基因工程11-大肠杆菌基因工程.ppt

《基因工程11-大肠杆菌基因工程.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第十三章大肠杆菌基因工程D基因工程菌的遗传不稳定性及其对策大肠杆菌基因工程C大肠杆菌基因工程菌的构建策略B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多

2、的内毒素B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数启动子启动子最佳距离的探测目的基因EEAEE启动子A酶切开Bal31酶解目的基因启动子的构建-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列

3、，形成长短不一的mRNA混合物。很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录一分子mRNA所需时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；过长的转录物会形成二级结构，大大降低外源基因编码产物的翻译效率强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上

4、的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它识别并与16SrRNA3’端的3’AUUCCUCC5’专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动

5、翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点；SD序列与翻译起始密码子之间的距离重要而碱基组成不重要；在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。基因编码区5’端若干密码子的碱基组成也较重要，这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。核糖体结合位点的结构生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（

6、如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；细胞内tRNA的含量使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的策略：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因对于那些含有稀有密码子出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中

7、7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。同步表达相关tRNA编码基因质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而

8、导致重组质粒的不稳定性以