资源描述：
《血管内皮细胞体外损伤模型探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、血管内皮细胞体外损伤模型探究(辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032)摘要：目的：研究高脂血清对血管内皮细胞(VEC)的损伤，探讨体外VEC损伤模型的方法，为进一步开展防治动脉粥样硬化(As)的研究奠定基础。方法：复制高脂血症大鼠并获取高脂血清，以此高脂血清培养VEC,酶联免疫法(ELISA)检测培养上清液的vWF、TXB2、PGI2含量，观察普通光镜、透射电镜下血管内皮细胞形态。结果：高脂血清致VEC培养上清波vWF、TXBz含量增加，PG12含量减少，VEC形态及结构损伤。结论：高脂血清可导致血管内皮细胞形态、结构及功能损伤。关键词
2、:VEC；透射电镜；vWF；TXB2；PGI2中图分类号：R-33文献标识码：A文章编号：1673-7717(2007)05-0919-03血管内皮细胞的损伤是形成动脉粥样硬化(atherosele—rosis,AS)的实因素之一，大量文献表明高脂血症是导致血管内皮细胞损伤的主要因素，对血管内皮细胞(VEC)损伤的体外研究是AS动物实验的互补研究，并可能具有优势，而血管内皮细胞(VEC)损伤的模型是体外研究的关键。本试验以高脂血清培养血管内皮细胞(VEC),复制VEC损伤的模型，进一步观察VEC形态改变的机理。1实验材料1.1实验动物与实验细
3、胞健康老年雄性Wistar大鼠由中国医科大学实验动物中心提供；人脐静脉内皮细胞细胞系（HUVECs）购自中国典型物保存中心（VEC-304）。1.2试剂与设备普通饲料（5%脂肪，55%碳水化合物,22%蛋白质，7%灰粉，5%纤维素），高脂饲料…（胆固醇4%,熟猪油10%,丙基硫氧囉唳0.2%,普通饲料85.8%）,人血浆vWF,TXB2、PGI2试剂盒由苏州大学血栓与止血研究室提供。大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。C02孵箱由FisherSeientific提供；JEM—1220透射电镜由日本电子公
4、司提供；酶标仪由LabsystemsMultiskanAscent提供。2方法2.1动物分组与造模将健康老年雄性Wistar大鼠，12只（体重400〜500g,月龄21月），随机分为2组：①空白组（6只）：用普通饲料喂养1周；②造模组（6只）：喂饲高脂饲料3周，同时并于第1天起注射地塞米松1.5mg/（kg•d）,连续10天。2.2高脂血清的制作将2组大鼠麻醉后腹主动脉采血，分离血清，针头滤器（0.45mm）过滤，置于561水箱中30rnin灭活补体，放于一20£冰箱中保存备用。2.3VEC的培养及高脂血清对VEC的损伤血管内皮细胞VEC-3
5、04复苏、传代培养后，生长良好的内皮细胞，制成单个细胞悬液，调整细胞数为5X106cm2接种于96孔板，补足培养液至200uL,待细胞贴壁融合生长，倾去培养液。24h组：空白组（6孔）加入含20%正常鼠血清+80%无血清DMEM；损伤组（6孔）加入含20%高脂血清+80%无血清DMEM,37°C5%C02孵箱中培养24h。48h组：空白组（6孔）加入含20%正常鼠血清+80%无血清DMEM,37°C5%C02孵箱中培养24h,去上清液，加入含20%正常鼠血清+80%无血清DMEM,37°C5%C02孵箱中培养24h；损伤组（6孔）加入含20%
6、高脂血清+80%无血清DMEM,37°C5%C02孵箱中培养24h,去上清液，加入含20%高脂血清+80%无血清DMEM,37°C5%C02孵箱中培养24ho2.4VEC形态的观察将细胞悬液加入100mL培养瓶中,补足培养液至10mL,余方法同前。高脂血清的施加比例：各种大鼠血清与培养液（无血清DMEM）之比为20:80,光镜标本以lOOmL培养瓶中细胞，按以上分组加不同血清培养液，分别培养后去上清液，放于倒置相差显微镜下观察；电镜标本以lOOmL培养瓶中细胞，按以上分组加不同血清培养液，分别培养后去上清液，用0.25%戊二醛原位固定2h,用
7、橡皮铲刮下细胞，将悬浮细胞转至离心管内，低温高速离心机2000r/min离心10min,PBS冲洗,1%餓酸（0s04）固定2h,系列酒精、丙酮脱水，环氧树脂（EPON）8h包埋，LKB-V型超薄切片机切片，醋酸铀柠檬酸双色染色后送检。2.5测定VEC培养上清液中vWFTXB2PGI2含量取96孔板培养液上清，以双抗体夹心固相酶免疫试验方法测定培养上清液中vWF含量；酶联免疫法测定培养上清液中TXB2.PGI2含量，具体操作按说明书。2.6统计学方法计量资料以平均数土标准差(x±s)表示，组间比较经方差齐性检验后，用成组t检验，以P<0.05
8、为有统计学意义，以SPSS11.0处理数据。3结果可见造模后大鼠甘油三酯、胆固醇、低密度酯蛋白明显高于正常对照组，高脂血症大鼠造模成功，所取血清为高脂血清。2.2v
