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1、现代药理学研究方法作业3110103759约学1101班邵鑫1、简述常用的检测凋亡的药理学研究方法?(1)双重荧光素染色细胞发生凋亡时，胞膜的通透性增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。根据这一特点，叮采用荧光素染色、流式细胞仪检测来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。YOPRO・1(YP)是一种膜不通透型DNA交联荧光染料。在细胞凋亡的早期,当细胞膜通透性发生微小变化时,YP可进入细胞核而与DNA结合,产生绿色荧光。碘化丙唳(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能够透过凋亡中、晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染色。应用YP与P1联合染色可将细胞区分为
2、正常细胞(YP-/PI-).早期凋亡细胞(YP+/PI-)、中晚期凋亡细胞和坏死细胞(YP/PI)o(2)DNA断裂当细胞凋亡或坏死时，核内DNA均发生断裂，高分子量DNA减少，小分子量DNA片段壊多并11出现在胞质内。但凋亡细胞DNA断裂点冇规律地发生在核小体之间，出现长度为180〜200bp的DNA片段，电泳时呈现阶梯状条带;而坏死细胞的DNA断裂点无规律性,产生的杂乱片段在屯泳吋呈现模糊的连续性条带。利用此特征可以确定郡体细胞的凋亡，并可与坏死细胞相区别。(3)原位末端检测技术此技术是指将细胞(或组织)固定后，应用标记的脱氧尿昔三磷酸(dUTP)在原位检测DNA裂
3、解点的技术。DNA片段原位末端检测技术又口J分为两种:脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)和原位切口平移(,ISNT)技术。TUNEL法的作用原理是，在细胞凋亡时,染色质DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3c-OH端，在脱氧核糖核昔酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核昔酸(多为dUTP)与荧光索、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物索形成的衍生物标记到DNA的3c-OH端，可通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。(4)连接介导的PCR检测DNA梯形片段当凋亡细胞数量少以及检测样品量小(如活体组织切片)时，无法直接应用琼脂糖屯泳观察凋亡细胞核DNA的变化。
4、Ckmtech公司的LM-PCRLadderAssayKit借助特异性接头，通过LM-PCR专一性地扩增核小体的梯形片段，从而可提高凋亡检测的灵敏度。亦口J采用LM-PCR对凋亡细胞进行半定量分析。(5)膜联蛋白V法磷脂酰丝氨酸(PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。膜联蛋白O(AnnexinO)^一种相对分子质量为35〜36ku的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。因此,应用膜联蛋白O法可鉴定早期细胞凋亡。将膜联蛋白O用荧光索(FITC,PE)或biotin标记，以标记膜联蛋白0的作为荧光探针,利用流式细
5、胞仪或荧光显微镜可检测凋广的细胞。(6)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性检测继线粒体$7m变化Z后,线粒体膜通透性增强，外膜可容许蛋口质通过，而内膜通透性变化不大。这时，正常位于线粒体双层膜间隙中的可溶性蛋口质会释放至胞浆。因此SIMPs的检测可为细胞凋亡的发生提供佐证。其小，细胞色素C作为一种信号物质在细胞凋亡中发挥着重要的作用。止常情况卜•，它存在于线粒体内、外膜Z间的腔隙小,凋亡信号的刺激使其从线粒体释放至细胞质与凋亡蛋口质激活因了1结合,形成细胞色素C/Apa-fl复合物，从而启动caspase级联反应。应用原位免疫荧光技术可检测细胞色素C和凋亡诱导因子,述可提供更精
6、确的蛋白质的亚细胞定位信息。(7)流式细胞术流式细胞术是检测细胞凋亡的有力工具，具有检测的细胞数量大、可定量分析群体细胞的凋亡以及可同时进行其他相关分析的特点。DNA含量分析是流式细胞术检测细胞凋亡的常用方法。细胞凋亡时,细胞膜的通透性增加，使广泛断裂的DNA小片段不能完全封闭于细胞屮，检测前对细胞的固定和洗、染处理更加剧细胞膜破裂,促进了DNA片断从细胞内逸出。因此，凋亡细胞DNA含量减少，与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧必强度降低，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现凋亡细胞峰。一般在细胞固定后用任何一种能与DNA结合的染料染色均可，但一•般常用PI,因为检
7、测它的荧光波长是口前流式细胞仪所常备的。DNA含量测定对于检测细胞凋亡具有一定的局限性，其特异性不很高。主要由于亚G0/G1峰的细胞数ri只代表了核碎片的数ri,并不代表凋亡细胞的数非整倍体细胞、机械损伤的细胞亦可出现亚G0/G1峰。4、根据SFDA新药报批要求，请设计用于评价阿尔兹海默病新药临床前药理学研究方案？设计阿尔兹海默症的动物模型：1)选择性胆碱能神经毒素所致的动物模型向大鼠脑室注射特异性的胆碱毒1■乙基-1-(2-^乙基)■氯化氮丙噪(AF64A),人鼠会出现胆碱能系统和记忆功能损害。AF64A,!-乙基亠(2■疑乙基)■氯化
