资源描述：
《焦化废水活性污泥中phb生产菌的筛选、鉴定及合成phb条件研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、焦化废水活性污泥中PHB生产菌的筛选、鉴定及合成PHB条件研究【摘耍】PHB（聚B-轻基丁酸酯）由于具有生物可降解性和生物相容性等性质，可以广泛应用在材料、医学、农业和环境保护的领域中。基于在环保领域对PHB的需求量高，希望通过廉价物质作碳源去筛选出PIIB的生产菌株，可以大量合成PHB,且降低成本。本研究从焦化废水的活性污泥屮提取出菌液，通过几种碳源的培养液屮培养，在平板上分离，得到单菌株并再进行复集培养。通过苏丹黑染色法鉴定5种菌株有积累PHB的能力，川硫酸降解法测定菌株产生的PHB的量，选出D2菌，细胞干重高为3.Olmg/mL,PH
2、B含量高达17.21%,K十分容易培养。预测所分离培养的D2菌具有培养PHB的工业化前景且节约了成本。【关键词】PHB；PHB生产菌；分离；鉴定；PHB提取1.研究背景1.1PI1B的用途聚B-轻基丁酸酯（PHB）作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可蜩性、耐磨性和抗射线外，更重耍的是其还具有生物可降解性和生物可相容性。因此，PHB在食品包装、农业、医药和环境保护等领域具有广泛的用途。在环保领域，通常需要高浓度PIIB将有机毒物（如：有机氯化物）吸收浓缩，以便进行下一步处理或回收。然而，虽然目前PHB的生产
3、方法很多如化学合成法、转基因植物生成法、微生物发酵法等等，但是却没有一种低成本、高产量的方法。1.2研究目的本文的最终目的就是通过选育出能够利用廉价物质作碳源高效积累PHB的菌株，从而得到大量生产PHB的方法。1.试验方法1.1制备培养基配制上述的培养基各1L,摇匀，调节pH在7.0左右。之后放入灭菌锅灭菌20min,取出放在4oC冰箱中保存。2.2菌株的初步培养从处理焦化废水的活性污泥中提取菌液，在已配好的各种碳源培养基（同B0D5浓度的乙酸钠、丁酸、葡萄糖、辛酸钠、月桂酸）100mL中各加1idL,放入培养摇床，在32oC,180r/m
4、in的条件下，培养48h。48h后，若观察到乙酸钠、丁酸、葡萄糖、辛酸钠均变浊，月桂酸比起对照样液混浊许多，则菌株的初步培养成功。2.3固体培养基的制备取上述的液体培养基100mL,加入琼脂，用玻璃棒混匀后，再放入灭菌锅屮灭菌20min,取出放入4oC冰箱。2.4菌种分离将上述所培养的菌液,分别稀释到10-5、10-6.10-7.10-8.10-9五个等级，各抽取20P1,接入固体培养基，用涂布棒快速地将其均匀涂布，再放入32oC的恒温箱中培养24ho24h后，观察是否长出菌落。2.5纯菌富集培养观察上述的培养24h的平板，找出单菌落分布比
5、较稀疏，清晰可见的平板，通过菌落的颜色、形状、表面等特征，找出平板上不同种的菌落。将不同种的菌落接入200也对应碳源的培养液中。放入32oC的培养摇床中，转速为180r/min,培养24h。得到高浓度纯种菌液。2.6生产PHB菌株的定性鉴定把苏丹黑染色液和番红复染液制备后待用。在无菌工作台上吸取各种培养好的单种菌液0.2mL滴于载玻片上，混匀且涂成薄膜，但注意涂布面不要太大。用钳子夹住载玻片，在电热炉上加热固定，使水分蒸干。滴入苏丹黑染色剂，混匀，室温下染色30min,发现载玻片呈黑色。用75%的乙醇清洗2min,使浮色去掉。滴上帑红复染液
6、染色2min,发现载玻片呈红色，用蒸馆水清洗1min,使浮色去掉。晾干，在显微镜下观察，若发现冇棕黑色或深黑色的类似细胞的颗粒，则可说明，该菌株具冇积累PHB的能力。2.7菌株生产PHB的定量测定(1)绘制PIIB浓度与吸光度关系的标准曲线。称取0.05g>0.1g、0.15g、0.2g>0.25g、0.3g>0.35g^0.4g>0.45g^0.50gPHB分析纯，均溶于10mL的氯仿溶液屮，再从氯仿溶液屮吸取0.1mL加入10mL的氯仿中，稀释PHB浓度100倍，再取稀释的PHB氯仿液0.1mL,滴入10mL的浓硫酸中，在100oC温度
7、下作用10min,冷却，混匀,得到对应PHB浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5ug/ml测定样品。将上述样品置于石英比色皿中，在235nm波长下，以浓硫酸为空白，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，PIIB浓度为横坐标，可制得一条标准曲线。（2）干细胞的烘制。取100mL的菌液，用离心机在4000r/min条件下离心20min,取沉淀物在80oC烘干至恒重，用电子天平称取干细胞的质量。将干细胞放入-20oC冰箱中冷冻，然后再放入沸水浴中，快速解冻，冷却再放入冰箱中，反复操作三次，以致达到破坏细胞结构的效果。（3）细胞
8、中PHB的提取。将冷冻的菌细胞用丙酮清洗三次，蒸干丙酮，加入10讥的氯仿-乙醇液（V：V二2：1）,在60oC下,提取PHB1h左右，过滤，得到10ml的PHB氯仿液。（4）用硫
