080微生物限度检查法

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1、作业指导书指导书编号DT1DC-SOP-080微生物限度检查法第1页共47页第二版第0次修订批准于如海初审贾敏1起草张建英微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数1简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微牛物污染程度的方法。也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所牛长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼

2、性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其它因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colonyformingunity,cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。2设备、仪器2.1设备2.1.1洁净实验室微牛物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。2.1.1.1结构和要求洁净实验室应釆光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平

3、整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LXo2.1.1.2温度、湿度洁净实验室内的温度应控制在18〜26°C,相对湿度最好在40%〜60%。2.1.1.3操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa,操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa.操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2

4、.1.1.4缓冲间缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。2.1.1.5洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工作业指导书指导书编号DT1DC-SOP-080微生物限度检查法第2页共47页第二版第0次修订批准于如海初审贾敏起草张建英业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1.表1不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准洁净级别尘粒数対浮游菌（个）/m3沉降菌(个)/(#90mm•0.5h)微粒直径MO.5pm微粒直径M5pm100级W3,500W0W5100

5、00级W350,000W2000W100W3100000级W3,500,000W20,000W500W10沉降菌数测定（II法）洁净实验室操作台消毒擦试处理后，先启动层流净化装置30min,将备妥的营养琼脂平板3个（经30~35°C预培养48h,证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30~35°C培养箱内倒置培养48h,取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查无菌操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。操作间和净化工作台要定期检测其洁净度，分别应达到10000级和100级。如

6、菌落数或微粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤设施，必要时予以更换。2.1.1.6在每次操作前、后用0.1%苯扎漠较溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置。2.1.2阳性菌实验室涉及实验室控制菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动，应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家II级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。2.1.3洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.

7、2仪器2.2.1恒温培养箱（30〜35°C）、生化培养箱（20〜25C）、微波炉、匀浆仪（3000-8000r/min）或作业指导书指导书编号DTIDC-SOP-080微牛物限度检查法第3页共47页第二版第0次修订批准于如海初审贾敏起草张建英康氏谡荡器、恒温水浴、电热干燥箱（100〜300°C）、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（40X〜1500X）、电子天平或药物天平（感量0.lg）,PI［计。2