第六章+植物细胞培养

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1、第六章植物细胞培养及次生代谢产物生产培养过程：培养物外植体愈伤组织不定芽根形成愈伤组织诱导培养基再分化培养基生根培养基植物细胞培养（PlantCellCulture）:在离体条件下，对植物单个细胞或小的细胞进行培养和继代培养，大量获得细胞群体的技术。植物细胞分离方法机械分离法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方法。优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。植物细胞分离方法愈伤悬浮法：从未分

2、化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团。优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离细胞或小的细胞团。植物细胞分离方法第一节悬浮培养细胞悬浮培养（Cellsuspensionculture)：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行悬浮振荡培养，使其增殖的技术。细胞悬浮培养技术悬浮培养包括：愈伤组织的诱导;悬浮系的建立与细胞的生长增殖(一)愈伤组织的诱导适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强。适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体适宜的培养基：适当的激素浓度；必要的附加物质多次继代筛选外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒

3、状，松散易碎。适于悬浮培养适于再生植株(一)愈伤组织的诱导(二)悬浮系的建立与继代培养愈伤组织1-2g愈伤/10-20ml培养基100、250ml三角瓶（30、70ml培养基）120rpm,25℃黑暗培养,初始培养换液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养100-110rpm（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为1周时（原悬浮液：新培养基=1：4）成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在20

4、～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。悬浮细胞的生长动态指指指1、细胞计数：单位体积细胞浓度；2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积；3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重(三)悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法第二节单细胞培养（singlecellculture）1、平板培养(platingculture)2、看护培养(nurseculture)3、微室培养(micro-chamberculture)4、双层滤纸培养(feederlayercultur)1、细胞平板

5、培养将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。细胞悬浮过滤与培养基混合植板培养克隆愈伤组织1、细胞平板培养平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率＝×100%每个平板接种的细胞总数1、细胞

6、平板培养优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。2、看护培养3、微室培养3、微室培养优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂

7、。把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。4、饲养层培养第三节规模化细胞培养生产次级代谢产物一、代谢产物(metabolites)初级代谢产物(Primarymetabolites)：生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。次级代谢产物(Secondarymetabolites)：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。二、植物次生产物的主要类