乙肝病毒DNA的实验室检测

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1、LOREMIPSUMDOLOR乙肝病毒DNA的实验室检测袁立云1、荧光定量PCR技术2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA与临床荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧

2、核糖核酸三磷酸（dNTP）实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光定量PCR技术PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重复退火5’3’5’3’5

3、’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循环24个拷贝循环38个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’荧光定量PCR原理插入染料法SYBRGreenI杂交探针法(最常用)TaqManTaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应体系变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’5’3’RQ退火5

4、’3’1.链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.检测荧光5’3’3’QTaqR5’l乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染（一）乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好乙肝病毒的感染（二）HBV-DNA与“两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”

5、、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。乙肝病毒的感染5.HBeAg阳性标本HBVDNA检出率90％左右HBeAg与HBVDNA有着良好的相关性4.也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。乙肝病毒的感染HBVDNAHBVDNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准ALT正常增高或者波动正常增高或者波

6、动免疫耐受期免疫清除期非活动或低（非）复制期再活动期肝组织学无明显异常,或轻度炎症纤维化中度或严重炎症、纤维化快速进展无炎症或仅有轻度炎症中度或严重炎症、肝纤维化临床诊断慢性HBV携带者HBeAg阳性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活动性HBsAg携带者HBeAg阴性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展2009HBV-DNA与临床HBVDNA检测的临床意义HBVDNA是HBV存在最直接的依据HBVDNA是HBV复制的标志HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA

7、对乙肝两对半起补充作用HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBVDNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断提供直接证据缩短“窗口期”HBVDNA检测的临床意义调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBVDNA来决定。HBVDNA检测的临床意义HBVDNA检测

8、的临床意义HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性？●干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。●PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能