赵威课件总结

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1、SV40入驿苗体EcoRIWWISnsmi鳩曲加i紬IWMUMfATPMS(弭#VHI)(4)EwBiTGAtNJiTGCTEcoPl.AGACCEcoK’AAdNMTGCEcoPlSiCAGCAG(S)姉M^lOOObpMMftNi2卜2M盘t1(7)DNA

2、晰t(1)HtMIHUttMUU1atm伽n(loXFMMmii1(IDtDNAJtl^Mu锹基因工程geneticengineering1.基因工程诞生的理论基础基因工程的诞生依赖于在此之前生命科学基础理论的发展成就，概括起來主要包括三个方血(1)40年代确定了遗传物质是DNA,它是遗传信息的载体。(2)50年代发现DNA

3、分子的双螺旋结构并揭示了半保留复制的机理，揭示了基因的口我复制和农达的机理。(3)50年代末至60年代初，和继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。2・工具酶的发现为基因工程的诞生奠加了技术的基础：3.基因工程的诞生1972年H.Boyer和P.Berg第一次完成了DNA的体外重组实验,用E.coRI在体外对SV40的DNA和X噬菌体的DNA进行了消化，然后用T4连接輛将消化后的DNA片段进行了连接，结果获得了重组的杂种DNA分子。1973年S.Cohen也成功的进行了另一个体外重纽实验，他将编码仃卡那每索抗性基因的大肠杆菌R6-5

4、质粒DNA与编码仃四环素抗性某因的另一种人肠杆菌质粒pSClOlDNA混合后加入内切酶EcoRl对DNA进行切割，再用T4连接酶将它们连接成巫组分子，用这种连接后的重组DNA转化人肠杆菌.结果发现,某些转化菌落表现出了既抗卡那痔索乂抗四环索的双匝抗性特征。以上两个实验带给人们的启示：DNA是可以在体外进行切割和拼接的利用细菌细胞可以快速的复制DNA并能够合成蛋门质。这两个实验也标致着基因工程技术的诞生基因工程所使用的名称：重DNA技术(recombinantDNAtechnique)遗传T•程(geneticengineering)基因工程(geneengineering)基因操作(

5、genemanipulation)基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)基因丁•程的基本内容：1・将两种不同來源的DNA一一即目的DNA和载体DNA提取纯化。2.用限制性内切酶处理DNA。3•用连接酶将切开的不同源的DMA连接剑一起,构成重组DNA。4.将重组DNA转化到人肠杆菌中。5.通过大暈的培养细菌，以达到扩增目的基【大I或表达蛋白的目的。基因工程的日的：进行分子克隆表达重组基因所编码的蛋白质工具酶一、限制酶(restrictionenzyme)全称限制性核酸内切酶、简称限制酶或内切酶。1.限删牍WO凰脛4凰1.限制腮的分类限制酶有三种:

6、I型、II型、III型。2.限制酶的命名一燉的限制酶通常山四个拉丁文字母组成第1个字母代表产生该酶的细菌的屈名,第2、3个字母代表产生该酶的细菌种名第4个字母代表产生该酶的菌株号。EcoRIIIEscherichiacoli种RY13株第3个被分离的酶3.限制酶的识别和切割位点根据I【型酶种类割双链DNA产牛3种不同的切II:⑴产生平末端⑵产生5,端突出的粘性末端⑶产生3,端突出的粘性末端6•限制郦使用的条件（1）缓冲系统：50mmol/Ltris.Cl10mmol/LMg++lnimol/LDTTNaCl⑵反应体枳⑶反应温度和时间⑷限制酶的商业化7•限制酶的商业化试剂公司的名称：P

7、romaga公司安玛西亚公司大连保生物公司北京赛百胜公司北京华美公司购买酶时的注意爭项：价格因索供货时间运输方式酶的保存修饰酶1•逆转录酶种类:禽类成骨细胞性白血病病毒（AMV）逆转录酶小鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶2.T4DNA连接酶从噬菌体中提取，用于DNA的连接3.碱性磷酸酶可将DMA或RM5'的磷酸去除，可用于制止不希望发生的连接反应进行。4•末端脱氧核苛酰转移酚用于将已标记好的单核昔酸加到DAN的3,端上,起到标记的作用；有时也可用丁-DNA片段的同聚尾的形成。载体（vector）在基因工程中的作用：将外源DNA插入其中，并一同转化或转染到宿主细胞中，能够稳定的保存下來

8、，完成外源DNA克隆和表达的功能。载体所必需的条件1必须冇自身的复制子，并能携带重纽DM-•起复制。2载体分了上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点。3载体必须具有可供选择的标?便丁•重组分子的筛选。4载体分子尽量小，便于能插入较人的外源DM,最好是爲考贝。5表达载体必须具备能在宿主细胞中表达的能力。一、常用的克隆载体㈠质粒plasmid1•质粒的一般特点细菌质粒是一些双链闭环的DNA分子，这些质粒都是独立丁•染色体Z外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通常，