微生物实验大论文

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1、土壤淀粉酶产生菌的筛选、分离纯化与活力测定201306230406冯夏艳浙江工业大学牛环学院生技1302班摘要：【目的】了解与掌握土壤淀粉酶产生菌的分离纯化、筛选、活力测定与生理生化反应测定。【方法】从土壤中分离产淀粉酶的微生物，对初步筛选到的淀粉酶产生菌进行复筛，对英进行摇瓶好氧培养，并用透明圈法测定微生物淀粉晦活性，最后进行简单的生理生化反应测定。【结果】经筛选并培养后的土壤淀粉酶产生菌有一定的活性，可根据淀粉陋透明圈的大小来判定，而.「L可通过简单的生理生化反应测定其基木性质。【结论】通过土壤屮淀粉酶产生菌的筛选，淀粉酶产生菌的分离纯化及产淀粉酶的摇瓶发

2、酵培养，一步步分离纯化，从而获得了纯化程度极高的淀粉酶产牛菌，并根据标准曲线测出了酶活力的大小。并通过细菌鉴定中的生理生化反应来了解细菌生理代谢情况，试验了细菌分解糖类物质产酸产气的情况，并用V.P试验和M.R试验检测的该菌呈阳性。关键词：土壤淀粉酶，划线分离，透明圈法，牛理牛化反应1材料与方法1.1材料1」」土壤淀粉酚产生菌的分离土壤样品培养基及试剂:牛肉膏蛋白淼培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99nl无菌水1瓶（带玻璃珠）、6支如1无菌水试管等;仪器及用具：无菌培养IIIL、无菌吸管、无菌水，酒精灯、无菌涂布棒（又名扩散棒、三角棒）、接种环、生物洁净工作

3、台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器（sc6）、移液器、移液枪等。1.1.2土壤淀粉酶产生菌的纯化淀粉培养基;前期筛选所得淀粉酚产生菌1.1.3土壤淀粉酶产生菌的发酵培养菌种：前期实验分离得到的菌种，大肠杆菌，枯草芽抱杆菌;仪器：超净工作台、恒温培养箱、摇床、发酵罐、发酵尾气分析仪、移液器、接种环、酒粘灯、记号笔等培养棊：液体发酵培养基。1.1.4淀粉酶的活性测定菌种：产淀粉稱微生物培养基：牛肉膏蛋白腺液体培养基，培养供试菌培养使用；仪器和其它用具：摇床、恒温培养箱、纸片、移液管、淀粉酶标准品、尺、小试管、容量瓶、离心机1.1.5淀粉酶产生菌的生理生

4、化反应菌种:大肠杆菌（EsdierichiacoD、枯草芽鞄杆菌（Bacillissubtilis）、藤黄八叠球菌（Samehahtea）、前期实验分离到的产淀粉酶菌株；培养基：糖发酵培养基（匍萄糖、乳糖或廉糖）、葡萄糖蛋白腺培养基、胰蛋白豚水培养基；试剂：甲基红指示剂、4%KOH,酚等。1.2方法一）土壤稀释液的制备1淋取土壤log放入9Qn氏菌水的三角瓶中，振荡10分钟，即为稀释Q1的土壤悬液。2另取装有无菌试管5支，用记号笔编上1能10-3.1（M10-5.IX1H在每支试管中用无菌吸管加入如tt菌水。諏已稀释成a1的土壤液，振荡后都止Q5nh用无菌吸管

5、吸取1ml土壤悬液加入100的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吸吹数次，使Z充分混匀，即成II土壤稀释液。同法依次连续稀释1氏IXIX1代土壤稀释液。在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底。二）划线分离1•每人取无菌培养HIL—副，标记。2収已熔化的淀粉培养基制平板挑取初筛平板上水解圈较大的单菌落，进行划线分离，倒置30分钟培养3待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后川显微镜观察是否为单一的微生物细胞，并转移到斜面培养基小，培养至成熟，待用。三）摇瓶发酵实验1.种子培养：将保存于冰箱的菌种接入新鲜斜面培养基,选择合适条件。若筛选获得的淀

6、粉酶产生菌为细菌。则30C培养箱中培养1一2天。将活化的菌种由斜面培养基转接入盛有30m聃子培养基的250m形瓶内，于转速18（T220r/mh旋转式摇床上30C培养1一2天。2发酵：吸取培养好的种子液anl接入多个帳有3Qn吸酵培养基的锥形瓶内，于转速180~220r/mh恒温摇床上3（JC培养厂天。醍取：取发酵液2Qnl平均分配到两个离心管小，12000r/mii离心10分钟，分别收集上清液和菌体，保存在冰箱中，以待淀粉酶效价的测定。四）标准曲线的制作1称取-定量的淀粉酶，溶于无菌水中，配制成一定的浓度的母液。冰干净的小试管，编号，将淀粉酶溶液稀释成lmg

7、/ml3-ng/ml3ng/ml4mg/ml5ng加脓度Slfc—•定量（100uD不同浓度的的淀粉酶标准液，滴于纸片上，置于倒冇培养基②的平板上，每幅培养基中均匀的放置纸片46张，在30摄氏度恒温培养箱中培养lT0h4测定透明圈直径5以淀粉酶活力对数值为横坐标，以透明圈直径为纵座标，绘制标准曲线。五）样品淀粉酶活力测定1、待测微生物接种于淀粉培养基，在30摄氏度摇床上培养约12hZ12000ipn离心10mh收集上清液;a取一定量OOuD上清液，滴于纸片上,置于培养基②，在30摄氏度恒温培养箱放置18^0h统一平板需在对称位置放置一标准品作为对照；4测定样品

8、和对照标准品的透明圈直径，并根据标准曲