2019-2020年高中生物 专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离导学案新人教版选修1 (I)

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1、2019-2020年高中生物专题5课题3血红蛋白的提取和分离导学案新人教版选修1(I)一、基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。2、凝胶实际上是一些微小的球体，这些小球体大多数是由构成的，如葡聚糖或琼脂糖。3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。（二）缓冲溶

2、液1、缓冲溶液的作用是。2、缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了，必须保持体外的pH与体内的。（三）电泳1、电泳是指。2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子的差异以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3、两种常用的电泳方法是和，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于，因

3、此，在测定蛋白质分子量时通常使用。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再加入（质量分数为），缓慢搅拌min，离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。2、血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明

4、的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的。（二）粗分离：透析取1mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的（PH7.0）中，透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的缓冲液。（三）纯化：凝胶色谱操作1、制作凝胶色谱柱2、装填凝胶色谱柱①装填前将色谱柱固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积，所以装柱前需要根据色谱柱的内

5、体积计算所需要的凝胶量。②装填时凝胶要缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填，色谱柱内不得有存在，一旦发现，必须重装。③装填完后，连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL物质的量浓度为20mmol/L的（PH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶。3、样品的加入和洗脱①准备：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面，关闭出口。②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意。加样后打开下端出口，直到样品后，关闭下端出口。③洗脱：小心加入物质的量的浓

6、度为20mmol/L的（PH7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待接近色谱柱时，用试管收集。（四）纯度鉴定：三、操作提示1、红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去；离心速度过高和时间过长会使一同沉淀，达不到分离的效果。2、色谱柱填料的处理商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1—2h。这种方法不但，而且可以除去凝胶中可能带有的，排除胶粒内的。3、凝胶色谱柱的装填在

7、色谱柱中装填凝胶的时候要尽量，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会，降低。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。4、蛋白质的分离在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带地移动，说明色谱柱制作成功。【教材答案】（一）旁栏思考题你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗

8、粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，，影响分离的效果。（二）练习1．答