02-性格的力量

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1、实验一、真核生物基因组DNA的提取、电泳掌握Southernblot的原理及基本步骤掌握人外周血基因组模板DNA的提取技术。学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。第一部分：裂解红细胞、蛋白酶k消化第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀基因组DNA第三部分：基因组DNA琼脂糖凝胶电泳第四部分：基因组DNA变性，中和及转膜二、实验内容三、主要试剂（稍后讲解）一、实验目的四、实验步骤（马上讲解）1）取0.3ml抗凝血置于1.5mlEppendorf管中.2）加入1mlSTMT溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。3）9,000rpm,离心3分钟(统一离心)。4）弃上清。弹管底重悬沉淀。实验第一部分裂解

2、红细胞、蛋白酶K消化注意事项：离心时离心机内样品平衡后对称放置加样器加样准确。4）加0.4ml生理盐水，悬浮细胞。5）9000rpm,离心3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。6）加460lNE溶液，混匀。7）加30l10%SDS,迅速混匀。8）加50l蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置50°C水浴1小时。操作注意事项：1、混匀时确认沉淀已被悬起。2、注意30ul、50ul加样体积准确。实验第一部分裂解红细胞、蛋白酶K消化核酸提取的主要步骤课间介绍真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1)破碎细胞2)去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应

3、注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA3)沉淀核酸乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化琼脂糖电泳PCRDNA提取步骤图解酚氯仿抽提二、各种试剂的作用成分：S:Sugar8%T:TritonX-1001%M:MgCl20.5mMT:Tris-HCl10mM(PH:8.0)作用：用Triton细胞膜上打孔，裂解细胞。从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。1、STMT溶液：作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分b.使蛋白质变性c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用成分：N:NaCl

4、50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性(螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。二、各种试剂的作用2、NE溶液：3、SDS：十二烷基硫酸钠终浓度0.5%4、蛋白酶K(或链霉蛋白酶)作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。无色酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液:Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。

5、在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉：0.1%黄色酚相指示剂抗氧化剂作用：去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。5、TE饱和重蒸苯酚：成分：氯仿作用：a.氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；b.氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；6、酚/氯仿7、氯仿/异戊醇(24:1)氯仿的作用：去除DNA水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。9、无水乙醇：作用：提供单

6、价阳离子。8、醋酸钠：3MNaAcpH:5.2核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等1、加入580ul(等体积)TE饱和酚,混匀1min.10000rpm,2min。(注意抽取下层酚相;轻柔混匀，避免DNA链断裂;)实验第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀5、加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml）混匀后置-70℃沉淀10min。4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。3、将上层

7、水相移至一新管中。加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。2、将上层水相移至一新管中，加入500ul(等体积)酚/氯仿，同上条件混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。注意事项：1）本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。；2）在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头