DB21∕T 2251-2014 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2251—2014猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirus2014-03-07发布2014-05-07实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2251—2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武顾贵波陈瑶赵晓彤赵凤菊刘坤洋关乃鹏王珊

2、珊刁贺军王冰邓文超IDB21/T2251—2014猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法的仪器和器材、试剂和材料、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于猪流行性腹泻的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验

3、室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）BP：碱基对（basepair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4原理PEDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列

4、设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2~8℃，-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管、0.2mL离心管、微量移液器和吸头。6试剂和材料1DB21/T2251—20146.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用新开

5、启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（士2）℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3′下游引物R：5′-CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3′6.10反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。6.11反转录引物：OligodT-AdaptorPr

6、imer（2.5μmol/L）。6.12阴性对照：DEPC水。6.13阳性对照：PEDV细胞培养物。6.14PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.15TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。6.16溴化乙锭。6.17DL2000DNAMarker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（士2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干烤

7、2h。7.1.3肠内容物的采集与前处理2DB21/T2251—2014采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.4粪便的采集与前处理用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5