土壤消酸还原酶测定-ZQX

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1、土壤硝酸还原酶测定（专用）关松荫酚二磺酸比色法—SunnyZhao1方法原理在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，土壤中硝态氮可还原成氨。测定土壤中这些酶的活性可了解土壤氮素转化中脱氨作用的强度。另外，硝酸还原酶还参与土壤中铁的还原作用。土壤硝酸还原酶的活性测定方法的基本原理：硝酸盐在硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和羟氨还原酶的催化作用下转化成氨，反应前后硝态氮的变化反应土壤硝酸还原酶的活性，硝态氮的变化可用酚二磺酸比色法测定。2试剂和材料2.1硝酸钾溶液[pKNO3=1g/100ml]：10.0g分析纯KNO3溶于

2、去离子水，稀释至1L。2.2葡萄糖溶液[pC6H12O6=1g/100ml]：10.0g分析纯葡萄糖溶于去离子水中，稀释至1L。2.3CaCO32.4铝钾矾[AlK(S04)2]饱和溶液。参考：（即明矾，不过明矾带12个结晶水，）明矾在20℃时溶解度是114g/L。2.5酚二磺酸溶液：取3g重蒸酚与20.1ml浓硫酸混合，在沸水浴中加热回流6h。（若无发烟硫酸，可用苯酚25.0g，加浓硫酸225ml，沸水浴加热6h配成。试剂冷后可能析出结晶，用时必须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻璃棕色瓶中，严

3、防吸湿。）2.6NaOH溶液[p(NaOH)=10g/100ml]：50g分析纯NaOH溶于去离子水，稀释至500ml。2.7硝酸钾标准溶液[p（KNO3）=0.1mg/ml]：精准称取分析纯KNO30.3258g溶于1L水中，（1L水中含有200mgNO3-N即为0.2mg/ml）。使用前将溶液稀释至0.1mg/mlNO3-N。标准曲线：吸取50.00mlKNO3标准溶液于100ml三角瓶中，在沸水浴上蒸干（或者烘干），残渣用2ml酚二磺酸溶液处理10min。加去离子水定容至500ml，其NO3-N浓度为0

4、.01mg/ml。从其中分别吸收0，1.00，3.00，5.00，7.00，9.00，11.00ml（对应的浓度分别为：0.2*10-3mg/ml、0.6*10-3mg/ml、1*10-3mg/ml、1.4*10-3mg/ml、1.8*10-3mg/ml、2.2*10-3mg/ml）于50ml容量瓶中，用10%NaOH调至微黄色。定容后在于400~500nm进行比色。样品：酶促反应后残留下的NO3-N含量和土壤残留NO3-N的含量设无土空白对照：用蒸馏水代替鲜土（基质里面的NO3-N含量）。设有土无基质（蒸馏

5、水代替）对照：不加基质（硝酸钾）。（土壤残留NO3-N的含量）3主要仪器分光光度计，恒温培养箱，100ml三角瓶，50ml容量瓶，瓷蒸发皿，水浴锅。4测定步骤取1g新鲜土样于100ml塑料瓶中，加20mgCaCO3和1mlKNO3溶液，混匀后加1ml葡萄糖溶液，另一种加入等量的蒸馏水代替底物（基质）。盖紧瓶塞（保证厌氧环境），轻摇塑料瓶（建议用100ml塑料瓶），置于30℃恒温培养箱中培养24h，同时试剂作空白对照。培养结束后加入50ml去离子水和1ml铝钾矾溶液，静置20min。混匀后过滤。（慢速定量7cm

6、滤纸）。【找大一点的瓶子，分开做两次】取20ml滤液于瓷蒸发皿（用锥形瓶中），在水浴中蒸干，加入2ml酚二磺酸溶液溶解处理10min，再加入15ml去离子水，用10%NaOH调至微黄色，最后移至50ml容量瓶中，定容后于400~500nm进行比色。5计算结果C0（样品溶液中NO3-N浓度含量的变化）=[C空-（C样-C对）]指的是变化量。土壤硝酸还原酶的活性[mgNO3-N—N/g/24h(d)]=C0Vf/dwt式中：C空：无土空白吸光值由标准曲线求得NO3-N含量。C样：样品吸光值由标准曲线求得NO3-N

7、含量。C对：有土无基质（硝酸钾）吸光值由标准曲线求得NO3-N含量(可以先不做)。V为待测液的体积（50ml）。f为分取倍数（50ml/20ml）。dwt为烘干土壤质量。