乳酸菌的分离纯化

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1、乳酸菌的分离与纯化1.实验目的2.实验材料2.1试验设备天平、牛角匙、电炉、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、500mL锥形瓶两个、250mL锥形瓶两个、试管20只、500mL烧杯两个、250mL烧杯两个、100mL烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。2.2实验仪器50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、75%酒精棉、冰箱。2.3实验药品新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、诗坛酸复红染液。3.试验

2、方法及操作过程3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持

3、30min。3.2倒BCG培养基平板的方法将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌）3.3脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。3.4乳酸菌的

4、分离纯化取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。3.5乳酸发酵及检查发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，40～42℃静止培养。检测：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行

5、革兰氏染色，显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。3.6实验具体过程两周实验具体过程5．21上午清洗仪器、下午配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板下午乳酸菌、划线分离、配脱脂乳试管100ml、灭菌、装10支试管5．22上午配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板下午等待灭菌5．23上午第一代接到脱脂乳试管、培养24h(21日平板仍染菌选相似菌落乳酸菌为第一代)下午做无菌水（20min灭菌121℃）、空锥形瓶灭菌装清明酸奶划线分离5．24上午配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、脱脂乳试管第二代划线分

6、离、脱脂乳试管做革兰氏染色下午等待灭菌5．26上午配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、第三代划线分离（光明由于染菌就此终断光明的接种）下午等待灭菌5．27上午第三代接种到脱脂乳试管中下午配制BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、5．28上午27日平板染菌，将剩余BCG牛乳培养基灭菌、倒平板、用脱脂乳试管做第四代划线分离及革兰氏染色下午等待灭菌5．29上午配酸奶培养基100ml两瓶、灭菌、冷却至不烫手为宜将第四代接种到酸奶培养基、待凝固下午写实验报告3.8.实验分析用提前灭好菌的烧杯取少量从市场上购买的（伊利、蒙牛）新鲜酸

7、奶，用接种环将两种酸奶接入已经配好的BCG培养平板中（注意整个过程应在无菌条件下操作），接好种后帖上标签进行培养。培养后的平板上大多都染上了杂菌，杂多为灰白色，只要个别平板长有淡黄色的乳酸菌菌落，且长势不好。第一代：选择长势较好的乳酸菌菌落，用接种针在无菌条件下将菌种接入两只脱脂乳试管中，接好种后帖上标签进行培养。结果：两只脱脂乳试管，一支凝固较好，颜色为乳白色略显黄，表面有淡黄色上清液，一支凝固不好。对试管中的酸奶进行了革兰氏染色，现象如下：显微镜下：有3种菌，革兰氏染色为紫色，有球菌、链球菌和少量细长的杆菌第二代：选择凝固较好的脱脂乳试管，用接种环在无

8、菌条件下将菌种接入BCG培养平板中，接好种后帖上标签进行培养。培养