微生物学实验技术-乳酸菌的分离与纯化

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1、一、目的要求：学习微生物菌种分离技术学习从新鲜酸乳中分离纯化乳酸菌的方法学习乳酸的检测方法酸乳中乳酸菌的分离纯化二、基本原理：选择适合于待分离微生物的生长条件，造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；加入某种指示剂，使待分离微生物在培养基中形成具有明显特征的菌落。微生物在固体培养基上生长形成单个菌落，挑取菌落平板划线获得纯培养。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。三、实验器材：菌种来源：市场销售的各种新鲜酸乳培养基：

2、BGC牛乳培养基乳酸菌培养基蛋白胨水培养基糖发酵培养基BGC牛乳培养基（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.G.C)乙醇溶液1mL,80℃灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH6.8,121℃灭菌20min。以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均匀后倒平板。乳酸菌培养基牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，氯化钠5g，水1000mL，pH：6.8；1.6%溴甲酚绿蛋白胨水培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH：7.2

3、~7.4糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL，pH：7.6，另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10mL。制法：1）将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH：7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管。2）将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121℃灭菌20min，糖溶液112℃灭菌30min。3)灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液0.5mL，则成1%的浓度。有关溶液：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100mL乙醇中，贮存于棕

4、色瓶中保存备用。吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，95%乙醇760mL，浓盐酸160mL。10%硫酸2%高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银2g，蒸馏水100mL，待硝酸银溶解后，取出10mL备用，向其余的90mL硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。四、操作步骤：（一）乳酸菌的分离纯化1.稀释分离培养基的配制灭菌倒平板制备样品稀释液接种（涂布

5、法）培养每组准备下列器材（灭菌）1.培养基A溶液（250ml三角瓶，内装125ml）2.培养基B溶液（250ml三角瓶，内装125ml）3.试管7支（内装9ml水）4.培养皿一包（9个）5.1ml刻度吸管7支1mL琼脂培养基每管各9mL无菌水取市售新鲜酸乳稀释至10-6，取其中的10-4、10-5、10-63个稀释度的稀释液各0.2mL，分别接入BGC牛乳培养基琼脂平板上，用无菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变黄者初步定为乳酸菌。2.划线分离挑取单菌落平板划线，置40℃培养

6、48h。挑选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达到提纯。（二）鉴别1吲哚试验1）试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管n+1支，分别标记乳酸菌和空白对照。2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。3）观察记录：在培养基中加入乙醚1~2mL，经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。2.糖发酵试验1）试管标记：取分别装有

7、葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各n+1支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。3）观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。3.乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10mL于试管中，加入10%硫酸1

8、mL，再加2%高锰酸钾1mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。五、结果分析1.乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状。2.乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为