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时间:2019-10-30
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1、RNAi技术及应用班级:生工092姓名:王友超学号:2009030318电话:15836067622RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesiliencing,PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种
2、现象,只是机制也更为复杂。作用机制干扰性小RNA(smallinterferingRNA,或shortinterferingRNAs,siRNA)是RNA干扰作用(RNAi)赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类长约21~25个核苷酸(nt)的特殊双链RNA(dsRNA)分子,具有特征性结构,即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性;siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.此外,每条单链的3′端均有2~3个突出的非配对的碱基RNAi的主要过程是,dsRNA被核酸酶切割成21~25nt的干扰性小RNA(siRNA),由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子
3、.细胞中dsRNA的形成是RNAi的第一步.细胞中dsRNA可通过多种途径形成,如基因组中DNA反向重复序列的转录产物;同时转录反义和正义RNA;病毒RNA复制中间体;以及以细胞中单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA等.在线虫(C.elegans)可以直接注射dsRNA或把线虫浸泡在含dsRNA溶液中等方式引入外源dsRNA,还可以通过喂养表达正义和反义RNA的细菌获得dsRNA.现已初步阐明RNAi的作用机制.RNAi的第一步是,dsRNA在内切核酸酶(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶)作用下加工裂解形成21~25nt的由正义和反义序列组成
4、的干扰性小dsRNA,即siRNA.果蝇中RNaseIII样核酸酶称为Dicer.Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在Arabidopsis,C.elegans,Schizosaccharomycespombe以及哺乳动物中也存在Dicer同类物.RNAi的第二步是,由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex,RISC),由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用.RISC由多种蛋白成分组成,包括内切核
5、酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等.线虫C.elegans中的MUT7(一种RNaseD样蛋白)可能是一种3′5′外切核酸酶.此外,PAZPPiwi蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis中的AGO1;N.Crassa中的QDE;C.elegans中的RDE1等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C同源.研究进一步揭示,ATP在siRNA介导的RNAi中具有重要作用.较长dsRNA向siRNA的转变要有ATP参与.siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白PRNA复合体;随之,siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA复合体(RISC),
6、此步具有ATP依赖性.RISC活性复合体对靶mRNA的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与.此外,ATP使siRNA5′端带上磷酸分子,且对siRNA的功能具有重要作用.上述过程中siRNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA双链体与细胞裂解物、ATP等孵育后再除去ATP及其它辅助因子,含有siRNA的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA分子siRNA可作为一种特殊引物,在RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者可被降解形成新的siRNA;新生成的siRNA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(randomdegra
7、dativePCR).新生的dsRNA反复合成和降解,不断产生新的siRNA,从而使靶mRNA渐进性减少,呈现基因沉默现象.RdRp一般只对所表达的靶mRNA发挥作用,这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能.每个细胞只需要少量dsRNA即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征.miRNA与siRNA的区别:(1)miRNA是单链的,而siR
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