整理生物化学与分子生物学实验

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1、实用生物化学与分子生物学实验1.分光光度计（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度。（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A＝-lgT＝εbcA：吸光度，又称光密度“O.D”；ε：吸光系数（L·mol－1·cm－1）；比例常数，称吸光系数b：样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，则b=1cm；c：样品浓度

2、（mol/L）。吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定文档实用260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数=8.2×103M-1cm，计算其摩尔浓度.∵A＝εbC∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10

3、-5mol/L（2）等电点的计算方法；标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。（2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。（3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。文档实用2、酪蛋白的提取过程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.8。利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后

4、便可得到纯化的酪蛋白。(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH４.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠PPT后面问题：（1）醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？醋酸缓冲液：调节PH到等电点4.8。蒸馏水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂类物质。文档实用丙酮洗涤：脱水。（2）最后所得的沉淀中加入0.1mol/LNaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定。（3）制备高产率 酪蛋白的关键是什么？刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到4.7,越接近越好,这是最主要的。（4）

5、请设计另一种提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高浓度(NH4)2SO4溶液2、10000转/分,5分钟，去上清液3、95%乙醇4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液4、丙酮4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液5、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、双缩脲法测蛋白质含量(1).蛋白质测定的5种方法:凯式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法双缩脲法（Biuret文档实用法）Folin-酚试剂法（Lorry法）考马斯亮蓝法（Bradford法）TCA：三氯乙酸4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量文

6、档实用原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合，使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度A595，与蛋白质浓度成正比。(1).干扰物质有哪些？TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等(2).G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基，染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，

7、适于作定量分析。(3).PPT后的4个思考题。说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？ 只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g文档实用氮，试验中可以除去非蛋白氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是相对于标准蛋白含量而言的。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些？(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同

8、蛋白质时有较大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等。(3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。在实验中，