生物化学与分子生物学实验指导书

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1、生物化学实验指导书生命科学与工程学院2007.09目录实验一总糖的测定2实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应5实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应9实验四 氨基酸的分离鉴定―纸层析法13实验五血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳15实验六酪蛋白的制备18实验七酵母核糖核酸的分离及组分鉴定20实验八肝细胞核中核酸（RNA和DNA）的分离与测定22实验九紫外吸收法测定DNA含量25实验十维生素C的定量测定26实验十一酶的特性29实验十三小麦萌发前后淀粉酶活力的比较37实验十四植物体内的转氨基作用40实验十五SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定

2、蛋白质分子量44实验十六葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量50实验十七质粒DNA的提取55实验十八质粒DNA的酶切57实验十九PCR基因扩增59实验二十琼脂糖凝胶电泳检测DNA61实验二十一真核生物基因组DNA制备63附录65实验一总糖的测定一、目的掌握直接测定法测定总糖的原理和方法。二、原理样品经处理除去蛋白质等杂志后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。三、器材1.电炉2.滴定管3.锥形瓶4.容量瓶四、试剂1.6mol/L盐酸溶液2.0.1%甲基红乙醇溶液：

3、称取0.1g甲基红，用60%乙醇溶解并定容至100ml。3.20%氢氧化钠溶液。4.0.1%转化糖标准溶液：称取105℃烘干至恒重的纯蔗糖1.9000g，用水溶解并移入1000ml容量瓶中，定容，混匀。取50ml于100ml容量瓶中，加6mol/L盐酸5ml，在68-70℃水浴中加热15min，取出于流动水下迅速冷却，加甲基红指示剂2滴，用20%NaOH溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。此溶液每毫升含转化糖1mg。5.费林氏A液：称取15g（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水并稀释到1L。6.费林氏

4、B液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1L，贮存于橡皮塞玻璃瓶中。7.乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌（Zn（CH3COO）2·2H2O），加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释至100ml。8.10.6%亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，溶于水,稀释到100ml。五、操作1．样品处理取适量样品，移入250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸锌溶液和5ml亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液

5、，收集滤液备用。吸取处理后的样液50m于100ml容量瓶中，加入5ml6mol/L盐酸溶液，置68-70℃水浴中加热15min，取出后迅速冷却，加甲基红指示剂2滴，用20%NaOH溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。2.碱性酒石酸铜溶液的标定准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9ml转化糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加转化糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗转化糖标准溶液的总体积。平行操

6、作3次，取其平均值，按下式计算。式中：F——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg；C——转化糖标准溶液的浓度，mg/ml；V——标定时消耗转化糖标准溶液的总体积，ml3.样品溶液预测准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3粒，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态，待溶液兰色变浅时，以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。4.样品溶液测定准确吸取

7、碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒，从滴定管滴加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。5.实验计算式中：F——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg；V1——样品处理液总体积，ml；V2——测定时消耗样品水解液体积，ml；m——样品质量，g。注意事项总糖测定的结果一般以转化糖计，但也可以葡萄糖计

8、，要根据产品的质量指标要求而定。如用转化糖表示，应该用标准转化糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液，如用葡萄糖表示，则应该用标准葡萄糖溶液标定。思考题本实验中为什么要对碱性酒石酸铜溶液进行标定？实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应一、目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。二、