副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术规范性审查稿

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1、ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/XXXXX—XXXX副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术TechnologyofReal-timePCRAssayInHaemophilusparasuisXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施山东省质量技术监督局发布DB37/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉

2、玉、杜以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。5DB37/XXXXX—XXXX副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术1　范围本标准规定了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的要求。本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　

3、Ct值　Cyclethreshold每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4　缩略语下列缩略语适用于本文件。HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）5　仪器与试剂除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。5.1　微量可调移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL）。5.2　高速冷冻离心机。5.3　荧光定量PCR仪。5.4　水浴锅。5.5　恒温培养箱。5.6　-20℃冰箱。5.7　二级生物安全柜。5.8　超低温冰箱：可控温至-70

4、℃。5.9　10mL抗凝采血管。5.10　一次性无菌5mL注射器。5DB37/XXXXX—XXXX1.1　1.5mL无RNA酶离心管。1.2　0.2mLPCR薄壁管或八联管。1.3　PBS缓冲液。1.4　SYBRGreenⅠ核酸染料（含酶）。1.5　蛋白酶K（见附录A.1）。1.6　10%SDS液（见附录A.2）。1.7　70%乙醇（见附录A.3）。1.8　引物：P1：5'-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3'，P2：5'-ACACCGCTTGCCATACCCTC-3'。1.9　标准阳性对照：HPSinfB基因阳性质粒。1

5、.10　标准阴性对照：无菌超纯水。2　方法2.1　样品采集2.1.1　活体采样：无菌采集抗凝血。2.1.2　病死猪采样：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。2.1.3　细菌培养物：37℃培养24h～48h的细菌培养物。2.2　样品处理2.2.1　组织样品处理：取肺脏组织3g～5g于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨。2.2.2　细菌培养物处理：挑取3～4个细菌单菌落加入100μL灭菌水中，煮沸10min后，再放置-20℃冻结。冻融后，10000r/min离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃保存备用。2.3

6、　核酸提取2.3.1　取样品500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL，加入10%的SDS溶液25μL，55℃水浴2h～3h。2.3.2　加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000r/min离心15min。2.3.3　取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000r/min离心15min。2.3.4　取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000r/min离心15min。2.3.5　取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静止20min，10000

7、r/min离心15min，弃上清。2.3.6　加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。2.3.7　加入100μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。2.4　荧光定量PCR反应体系荧光定量PCR反应体系，详见附录B.1。2.5　荧光定量PCR程序设定每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，具体参数见附录B.2。3　结果判定5DB37/XXXXX—XXXX1.1　试验成立条件1.1.1　阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。1.1.2　阳性对照Ct值＜30，并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。1.2　判定1.2.1　阴性Ct值＞

8、35，表明样品为阴性。1.2.2　阳性Ct值＜30，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在HPS。1.2.3　疑似30≤Ct值≤35的样品须重检，结果仍然在该区间，判定为阳性。5DB37/XXXXX—XXXXAA附　录　A（资料性附录）试