浅谈基因工程的技术

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1、浅谈基因工程的技术姓名:唐小惠学号：1401420107摘要：本文主要围绕基因工程的几大技术主要包括DNA序列分析、分子杂交（Southern杂交、Northern杂交、Western杂交、原位杂交技术），DNA的提取与纯化，DNA的凝胶电泳，PCR扩增技术开展论述。关键词：Southem杂交、Northem杂交、Westem杂交、PCR扩增、原位杂交技术。1、基因工程的介绍基因工程是在体外将目的DNA（来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA）系统进行重组，再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复

2、制和表达的过程。基因工程研究步骤是：第一，从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段；第二，在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子；第三，将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖：第四，选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增；最后，进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。2、DNA的提取与纯化2.1质粒DNA的提取原理在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的

3、染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。2.1.1质粒DNA提取的溶液配制溶液I的配制：50mM葡萄糖，25mMTris-HCI（pH8.0）,10mMEDTA,4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA。溶液II的配制：0.2NNaOH,1.0%SDS。溶液III的配制：3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）。2.1.2质粒DNA提取的操作步骤第一步，溶菌，使用“溶液I”溶解细菌细胞壁；第二步，破膜，蛋白质和DNA变性溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性；第三步，中和，溶液III使DNA复性、并促使蛋

4、白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。2.1.3影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数，质粒的大小。2.2基因组DNA的提取原理及过程细胞裂解，DNA纯化和沉淀。3、DNA的定量和纯度测定3.1紫外光谱法的原理DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。而蛋白质在280nm处有吸收峰。3.1.2紫外光谱法的使用仪器用微量比色杯（10I）在紫外分光光度计直接测定。3.2琼脂糖凝胶电泳估计的原理漠化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发橙红色荧光。EB在300nm紫外光照射

5、下能发橙红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。3、DNA的凝胶电泳3.1电泳的基本原理带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分

6、子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关：分子量越大，移动越慢。3.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“月东”。4、分子杂交4.1Southern杂交4.1.2Southern杂交基本原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙

7、膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。4.1.3Southern杂交基本步骤Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹：二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。第一，待测核酸样品的制备（制备待测DNA、DNA限制酶消化）；第二，琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品。原理是South

8、ern印迹杂交是先将DNA样品（含不同大小的DNA片段）先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.8-1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70-80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范