471-PCR的常见问题分析与对策

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1、PCR的常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当口电泳检测，人于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节冇①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋口质，②模板中含有Taq敢种剂，③模板中蛋口质?有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制

2、有效而稳定的消化处理液，其程序亦应I古I定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶?或新III两种酶同时使川，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或澳乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。冇些批号的引物合成质量冇问题，两条引物一条浓度高,一条浓度低，造成低效率的不対称扩增，対策为：①选怎一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一

3、条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物ZI'可形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离了浓度对PCR扩增效率影响很人，浓度过高对降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行PCR扩增釆用的体积为20ul、30ul、50ulc或lOOul,应用多大体积进行PCR扩增，是根

4、据科研和临床检测不同H的而设定，在做小体积如2()ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增來说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物为模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。“行列变异：如靶序?发生突变或缺火，影响引物与模板特异性结?，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性岀现的

5、PCR扩增条带少目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非忖的扩增序列冇同源性，因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。“行列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或人片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性町用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前,反应管和

6、试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气屮的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互和拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特杲性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特界条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多

7、有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时垂新设计引物。②减低酶量或调换另一來源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法（93°C变性，65°C左右退火与延伸）。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增河时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一來源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板址，减少循环次数。