免疫细胞化学染色在白血病免疫分型和肿瘤细胞骨髓转移

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1、免疫细胞化学染色在白血病免疫分型和肿瘤细胞骨髓转移鉴定中的应用前言白血病和肿瘤细胞骨髓转移的诊断主要靠骨髓细胞病理学诊断。骨髓细胞病理学诊断的方法主要有细胞形态学、细胞化学染色、免疫细胞化学染色、细胞遗传学以及分子生物学。根据文献报道，根据细胞形态对白血病进行分型的准确性是64%～77%。细胞形态学和细胞化学结合可使准确性达86%[2]，但对于AML-M0、M7、M5a、MAL鉴定有一定的困难。而免疫细胞化学染色在一定程度上可以解决此类问题。骨髓转移性癌（BMT）原发于非造血组织的恶性肿瘤转移至骨髓的总称，骨髓不仅是造血组织恶性肿瘤的好发部位，同时又是其它恶

2、性肿瘤常转移的部位。肿瘤经血行或淋巴管转移到骨髓，有的能找到原发灶，而有的找不到原发灶，这就需要在骨髓内直接鉴定肿瘤细胞。转移到骨髓内的癌细胞同血液系统的恶性肿瘤细胞及转移癌细胞之间，在形态上有一定的区别，而对于分化较差的癌细胞其形态较难辨认，易同急性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤细胞以及其它的肿瘤细胞如神经母细胞瘤、肾上腺母细胞瘤等相混淆不易鉴别。转移到骨髓中的肿瘤细胞无组织结构特点，加之肿瘤细胞化学染色缺乏一定的特异性，使转移性肿瘤细胞的鉴定具有一定的困难，也需要用免疫细胞化学染色来解决。一、免疫细胞化学染色定义免疫细胞化学或称免疫组织化学是指用免疫学原理，通过

3、特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成份的方法。此法可以识别定位各种细胞组织成份。如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、肿瘤的标记物等。在光学显微镜、荧光显微镜下观察其特定定位。二、免疫细胞化学染色理论基础（一）白血病免疫分型各种血细胞来源于多能干细胞，经过分化发育而成为成熟的血细胞。这些血细胞在分化发育过程中，在其表面出现不同阶段的特异性分化抗原，利用各种特异性单克隆抗体和酶联免疫方法测定这些抗原，从而精确测定细胞类型及不同的分化阶段。白血病细胞具有与其对应的分化抗原,因此利用分化抗原可对白血病进行免疫学分型。（二）肿瘤

4、细胞鉴定肿瘤是由正常细胞恶变所致，故细胞膜表面、细胞质内和细胞核内可能存在着与正常相比在质或量上明显异常的物质，这些物质可以成为抗原，因而可以用特异性抗体通过免疫细胞化学染色检测。由于来源于不同组织的肿瘤细胞因为其所含的蛋白质和酶的不同，利用针对这些蛋白质和酶的各种特异性单克隆抗体对肿瘤细胞种类鉴别。三实验方法种类（一）仪器法：流式细胞仪、自动免疫染色仪（二）手工法（玻片法）1根据二抗标记物不同：碱性磷酸酶法、辣根过氧化物酶法、荧光法、抗生物素-生物素法等。2根据实验原理：二步法、三步法等。四、免疫组化二步法染色原理将一抗滴加在玻片上，如果被标记的细胞含有特异

5、性抗原，则一抗抗体被结合，在洗涤过程中不被洗掉，再加入二抗酶聚合物与一抗结合。加入底物后，在酶的催化下细胞显棕黄色。如果细胞不含特异性抗原，就不能与一抗结合，一抗就被洗掉，整个反应就不能进行，细胞不显棕黄色。五、实验步骤1.选择厚薄均匀的骨髓涂片5～6张，根据需要用免疫组化圈笔在涂片上画直径1.5cm左右的圆圈数个。然后将玻片置于95%酒精溶液中固定5～10分钟或4℃丙酮10分钟。2.取出玻片用流水冲洗，再用PBS缓冲液冲洗，滴加3%H2O250μl，阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10分钟。3.PBS冲洗，5分钟×3。4.滴加非免疫动物血清50μl，室温孵育1

6、0分钟。5.根据形态学初检选择需要标记的第一抗体滴在圆圈内并做好记号，然后将玻片置于湿盒内室温下1.5小时或4℃过夜。6.PBS冲洗，5分钟×37.每个圆圈内滴加二抗与辣根过氧化物酶聚合物，置于湿盒内室温下0.5小时。8.取出玻片用PBS缓冲液洗5分钟×3。在每个圆圈内滴加DAB显色液，置于湿盒内室温下5-15分钟。9.取出玻片用PBS缓冲液冲洗，再用苏木精复染3分钟，流水冲洗晾干。10.在显微镜油镜下观察所要标记的细胞。六、实验结果细胞膜、细胞浆或细胞核上出现棕黄色或棕黄色颗粒则为阳性，说明此细胞含有针对所标记的单克隆抗体的抗原，如果不显棕黄色或棕黄色颗粒则

7、为阴性。七、注意事项1.标本应新鲜，彻底干燥后方能检测。通常放置24小时后检测,但标本采集后应在3-4天内测定完毕。若标本采集后不能及时测定，勿预先固定和冰箱内保存。2.滴加单克隆一抗时，格外小心避免混淆。3.滴加二抗、显色剂时无需分开。4.整个检测过程中自固定后标本均应保持湿润，不能干燥，直至复染后方能使其干燥。八、常用单克隆抗体及谱系特异性（一）白血病免疫分型常用单克隆抗体T林巴细胞：CD2CD3CD5CD7CD8CDlαTCR-αβTCR-γδB林巴细胞：CD10CD19CD20CD24CD22CD79αCyIgM髓系细胞：MPOCD13CD14CD15

8、CD64CD65CD68CD118血型