自发性高血压大鼠高敏C反应蛋白来源

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1、自发性高血压大鼠高敏C反应蛋白来源【摘要】目的：探讨自发性高血压大鼠(SHR)体内高敏C反应蛋白(hsCRP)的来源。方法：在SHR高血压形成过程中，检测血清hsCRP浓度的动态变化，并从蛋白和mRNA水平同时检测主动脉平滑肌和肝脏CRP的表达情况。结果：5周龄后SHR的收缩压随着周龄的增加而增加，其血清hsCRP水平和主动脉平滑肌CRP的表达量进行性增高，但其肝脏CRP却始终为低表达。相关分析显示，SHR的收缩压水平和血清hsCRP浓度呈正相关；主动脉平滑肌CRP的表达量与血清hsCRP浓度也呈正相关；但是肝脏CRP的表达量却与血清

2、hsCRP水平无相关性。结论：SHR高水平的hsCRP主要来源于主动脉平滑肌而不是肝脏。【关键词】C反应蛋白；高血压【中图分类号IR544.1【文献标识码】A【文章编号】1004—7484(2013)11—0020—02传统认为C-反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)是一个非特异性的炎症标志物，其合成主要在肝脏［1,2］。但是随着研究的进展，人们发现高血压等心血管病患者血清高敏C反应蛋白(highsensitiveC~reactiveprotein,hsCRP),即用超敏感的方法所检测到的低水平CPR,显著升高［3,

3、4］,但其高水平hsCRP的来源还很不清楚。自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)从5周龄开始收缩压即可达150mmHg,成年后最高可达200mmHg以上，适于人类的髙血压病研究。因此本课题利用SHR模型,在高血压形成过程中研究hsCRP的来源，为高血压防治提供实验理论基础。1材料与方法1.1实验动物所采用的实验方案符合江苏大学实验动物管理和使用委员会的规定。清洁级雄性SHR和Wistar京都种大鼠(WKY)购于中科院上海实验动物中心，实验前1周适应性饲养于气温22〜25°C.明暗交替(各

4、12h)的动物房中，自由进食大鼠饲料，自由饮水。实验分组：SHR和KWY各分为3周龄组(3W)、5周龄组(5W)、8周龄组(8W)和12周龄组(12W),每组各10只。1.2主要试剂抗体、免疫组化SP试剂盒和酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购于Takara生物工程(大连)有限公司。大鼠CRP引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3血压测量应用大鼠无创血压测量分析系统，采用套尾法，在大鼠清醒时测量其收缩压，重复3次，取平均值。1.4血清hsCRP的测定

5、大鼠禁食12小时后断尾采血0.5ml,41下3000r/min离心lOmin,分离血清，取上清液置EP管-20"保存。待实验结束后统一使用ELISA试剂盒，按说明书操作，测量血清hsCRP水平。1.5主动脉CRP表达的检测大鼠苯巴比妥钠腹腔注射、放血处死后，迅速小心分离其胸腹部的主动脉和肝右叶，冰生理盐水洗净淤血，分别取主动脉弓处0.5cm血管组织和0.5cm*0.5cm*0.5cm肝右叶组织置入10%中性甲醛缓冲液中固定24小时用于免疫组织化学染色，其余血管组织和肝右叶组织置入冻存管中-8CTC冰箱保存。1.5.1免疫组织化学染色(

6、1)SP法：对主动脉和肝组织标本分别进行常规石蜡切片，采用免疫组化SP法检测主动脉壁CRP的表达情况，按试剂盒说明操作。(2)免疫组化结果判定：CRP标记的胞浆呈棕色为阳性结果。免疫组化半定量法记录其中阳性细胞，得出阳性细胞百分数。1.5.2RT-PCR在冰块上用眼科剪小心去除肝右叶和主动脉外层结缔组织，并去除血管内膜，留取中层平滑肌组织。肝脏和血管平滑肌组织分别加入Trizol进行组织均浆，常规方法提取组织细胞总RNA后，参照RT-PCR剂盒提供的检测步骤说明进行操作。每个样品检测3次，取平均值。所用大鼠CRP引物序列:上游5，-C

7、ATCTGTGCCACCTGGGAGTC~3下游5’-AAGCCACCGCCATACGAGTC-3，；扩增片段为153bp（基因库编码为NM017096）o以大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）作为内对照，引物序列为：上游5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3，，下游5，-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3',扩增片段为124bp（基因库编码为NM017008）oPCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，漠化乙锭染色，Image

8、J1.37系统进行图像分析，得出CRPmRNA与GAPDHmRNA的比值。1.6统计学分析采用stata7.0件包进行统计分析。计量资料用均数土标准差（土s）表示，多样本比较用单因素方差分析（ANOVA）法，两两比较用S