实验常见问题分析

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1、第三部分Real-timeqPCR常见问题分析1•做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和H的基因？建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩増效率。2.熔解曲线中,Tm不出现在80度左右?扩增片段100bp左右的，-•般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。3.扩增曲线没有Ct值，仅仅-条斜线？什么原因？模板浓度过低或者模板降解。4.ROX校正为何可以导致熔解烽的不专一？ROX也是一种荧光染料，会冇荧光的发生。5•如果内参和H标基凶表达量差别比较人，也就是H的基因的表达量少，

2、Ctcon=15,Cttarget=3&可否应丿U?可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。6.引物浓度可否是50nM.是否太低？如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况卜一，同样可以运用。一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不耍用高的，会影响扩增效率。7.miRNA多个扩增时候，如杲一个的扩增效果比较，其它熔解Illi线不止一个峰，如何解决？Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不取的。那么只能是提高Tm或者更

3、换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。8.miRNA反转录引物和定虽:方法？与mRNA发转录及real-timePCR有和区别？一般常用的反转录primer有2种，一种step-loop的primer；一种是首先3末端加A,然后ployT再发转录。用于real-timeqPCR的上游primer都是针对miRNA结构木身的;卜•游冇个通用primer。定鼠町以用SYBRGreenI,也可以用Taqman。9.相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均厉在2deltCt还是分别2deltCt在平均比较好？相对

4、定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别:如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。10.熔解程序可否不加？如果是扩增效果好，特界扩增，可以不加熔解程序；但建议做好加上。11.扩增反应体系5pL,扩增效率低，什么原因？反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。12.如何减少非特界性扩増的干扰？设计-•对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温

5、度。如何提取高质量RNA1•迅速灭活内源的RNA腮，以防止RNA降解。以下3个方法均可冇效使内源RNA酶失活：1）用含离液（如呱盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：纽.织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活。3）立即将样品置于RNAfixer无液氮RNA样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（＜0.5cm）,这样RNAfixer才能在RNase破坏RNAZ

6、前迅速渗入组织块屮。2•使用正确的细胞或组织储存条件在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C,千力不能解冻。即使是置于含有弧盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研搐成粉，然后置于裂解液小进行匀浆。RNAfixer使样品储存更为便利。储存在RNAfixer的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°CoRNAfixer说明书下载•3.破壁方法细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止

7、RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型來选择。人部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡來匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常带耍更加剧烈的方法，通常用液氮研磨。比如说细菌（特别是革兰氏阳性菌）的细胞壁，就需要溶菌酶消化來实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。酵母和革兰氏阳性菌通常还需要液氮研磨过程中加入玻璃微珠帮助破壁，酵母提取也可以加入诸如Lyticase等破壁酶帮助破壁，再用TRIpure或RNApure进行提取。4.选择最好的RNA分离方法现冇众多的RNA分离方法也许令人难

8、以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如RNApure因为操作简单，时间短，纯度高而受到大家的喜爱，RNApure不需要DNA酶消化DNA,节省了时间，避免RNA的降解，从而提高了产量；相对非柱式分离（如TRIZOL）,去除蛋口及其他杂质干净，提高了纯度,对于细胞、组织、一般植物均非常适合。植物