elisa实验常见问题分析

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1、ELISA实验常见问题分析异常结果描述原因分析对策白板显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。错加、漏加试剂底物、显色剂A或B严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制每次配制时都应看清标签标明物质蒸馏水有问题确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好

2、蒸馏水比较。显色弱、灵敏度低实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。试剂盒超过期，超过有效期的产品可能会产生很弱的信号；试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。试剂、样品用前未平衡至室温从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡20分钟左右。加入试剂的体积和时间有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力确认盛酶标的容器不含酶

3、抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。孵育时间及孵育温度未达到要求，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。保温期内不宜多开门，以免影响保温。洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入底物作用时间不够；准确定时。蒸馏水水质有问题；测定

4、蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的如有怀疑，可复检标本加入叠氮钠作为防腐剂酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用proclin、硫柳汞等其他防腐剂阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受温度变化影响较大而被未检出质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴

5、度下降，而未能检出重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。仪器设定不正确，滤光片不匹配重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配灵敏度过高、板底高、高背景终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本OD值过高。整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测HbsAb板用于测HBsAg等；实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象；避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝显

6、色剂A、B未使用前避光保存孵育温度过高或孵育时间过长；孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。严格按说明书要求洗板未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成放置时间（自然放置1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。出现随机性的花板、跳孔现象样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；充分离心，3000rpm6分钟以上。加样时交叉污染；加标本时尽量避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。手工洗板造成的交叉污染手工洗板时前3次注洗液后应立即

7、弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成花板、跳孔疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。拍板时交叉污染洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。假阳性假阳性现象是一个综合现象，可参考上文“灵敏度过高、板底高、高背景”中的分析。这里只列举常见的原因及对策。计算Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的