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1、过表达ICE1基因在转基因水稻中表达提高抗寒性摘要:ICE1,一种拟南芥的转录因了，通过RT-PCR方法克隆并通过农杆菌介导的转化方法成功转化到稻品种垦鉴稻10。经过PCR扩增和Southernblot分析表明，ICE1已整合到水稻基因组中。与非转基因植物相比，转基因植物表现出高抗潮霉素B,和转基因ICE1的单拷贝基因的孟德尔遗传一致。在低温胁迫下，转基因植物表现出较低的死亡率，且脯氨酸含量增加。这些结果表明，拟南芥的ICE1在水稻中起到功能，而过表达的ICE1可以提高水稻的冷胁迫的耐受性。拟南芥的转录激活因子在低温下激活
2、ICE1并刺激CBF/DREB基因表达。随后，将活化的中CBFs/DREBs结合CRT/DRE顺势作用元件（GAC）在启动子区域，连同其它蛋白质（RNA聚合酶等）相互作用，最后诱导下游冷反应基因（COR）以及其他低温驯化基因表达。这一过程通过改变可溶性糖和脯氨酸的含量，并最终提高了植物耐寒性。ICE1的组成型农达提高了拟南芥抗寒能力。克隆拟南芥CBFs/DREBs同源基因，在水稻中命名为DREB1A,OsDREBIB,OsDREBIC,OsDREBlD和DREB2A。Chen等克隆OsDREBL大米，和Tian等[8]克隆
3、水稻3转录因子（OsDREBl-1,0sDREB4-l和0sDREB4・2）。验证了，大部分的克隆的基因的口J以在CRT/DRE顺势作用元件下结合在COR启动子区域。直到现在，大多数水稻抗寒基因已被分离和鉴定，但未见拟南芥ICE1基因在水稻屮的相关报道。此外，CBF基因的转录水平不受冷胁迫调控，这里一个潜在的分子生物学基础。我们通过转化拟南芥ICE1提高水稻耐冷性提供。在这项研究中，我们成功地将拟南芥转录因了基因ICE1转化到水稻品种星鉴稻10,并研究了ICE1转化对水稻品种垦鉴稻10耐冷低温的影响。植物材料质粒和菌株植物
4、表达载体命名pCAMBIA1300-35S-ICEl-polyA的构建（图1）,其屮载有ICE1cDNA片段和选择标记基因的HPT,抗对潮霉素B的CaMV35S启动了。Hr:Fig.1.SchematicdiagramoftheplantexpressionvectorpCAMBIA1300-35S-7CE/-polyA.培养基愈伤MS+2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA再生MS+2mg/L6-BA生根1/2MS+0.5mg/LNAA基因克隆和植物表达载体的构建通过酶切和序列分析检查后，ICE1
5、的PCR产物用EcoRI和Xbal酶切，然后在pRT104载体的CaMV35S启动和聚A之间插入，用PstI酶切后,将CaMV35S启动-ICEl-polyA的片段插入到pBluescript中质粒比用BamHI和SalI消化CaMV35S启动-ICEl-polyA的片段插入到pCAMBIA1300载体农杆菌介导的愈伤组织转化从垦鉴稻10成熟胚诱导水稻愈伤组织由Hiei等报道了农杆菌介导的方法转化。第二选择后，将潮霉索抗性愈伤组织转移至再生培养基并15小吋光照的光周期卜•培养。约2厘米高度将再生植物转移到生根培养基。当植物
6、达到了10厘米的高度，管盖被拔岀。两天后培养，将植物转移到盆屮的土壤。转基因植物进行试验以筛选阳性的。转基因稻植物的检测捉取水稻的DNA进行PCR检测，并捉取了全基因组DNA进行Southernblot.。将DNA用EcoRI酶切，进行电泳，转卬到膜上，并固定。同时，野生型水稻DNA和表达载体(ICE1和polyA多聚腺昔酸Z间没有任何的EcoRI酶切位点，,图1Z间的限制性位点)被分别用作阴性和阳性对照。ICE1基因的探针根据DIGDNA标记和检测试剂盒的说明合成和检测。与固定单链DNA的膜浸渍在预杂交缓冲液。预杂交后，
7、将膜转移到含有标记探针的杂交溶液。T1代和非转基因植物的种子表而灭菌，接种在100毫克/升潮霉素的MS培养基上。潮霉索抗性T1代转基因后代的分离根据以下公式计算：Z2=(
8、4-3q
9、-2)2/3(A+g)（A是潮霉素抗性的种子数量，a是数潮霉素敏感的种子，DF=1,a=0.05,x2（0.05,1）=3.84）o然后将潮霉索抗性的种子在土壤中播种。当幼苗约10厘米的高度，它们在4°C经受冷处理在冰箱中3天，然后返回到23°C的恒定环境。观察植物的牛长，并计算低温处理后的枯萎速率。水稻脯氨酸含量叶T1代和非转基因植物中的13
10、犬（冷处理前）和第16大（冷处理Z后）的苗龄通过该方法，。四个复制测量每个样品进行。转基因水稻植株PCR检测总共在研究43个体转基因稻植物的通过PCR检查。约1500碱基的ICE1基因在12个单独的转基因植物（图5）被捉岀，但是否定的CK和英他个体植物不存在,这表明ICE1基因已整合到水稻基因组中为28
