石蜡包埋制片技术原理与流程-资料中心-生物在线

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1、组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂

2、，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织屮的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。1.固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4°C并向固定过夜。2.脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%(3次)3.渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块屮透明剂的过程

3、，一般用熔点为52-60°C的石蜡。透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37°C渗透过夜，后温度调至58°C换入纯石蜡继续渗透，一-般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。4.切片与展片先用刀片修去组织块周闱多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上,冷凝后即可进行切片。-般组织切片的厚度为6-12um,切片速度以40・50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下

4、放，后滴上适量的蒸馅水放至展片台上于37-40°C烤片过夜。5.染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。具体流程如下所示：帝红•固绿双重染色法：纯二甲苯(20min)-纯二甲苯(20min)->1/2酒精+1/2二甲苯(2-3min)-100%酒精(2-3min)-95%酒精(2-3min)->85%酒精(2-3min)-75%酒精(2-3min)-50酒精(2-3min)-番红染液(30-lh)-50%酒精(30s)-75%酒精(30s)-85%酒

5、精(30s)-95%酒精(30s)〜固绿染液(7s)->95%酒精(30s)->100%酒精(30s)->1/2酒精+1/2二甲苯（30s）-纯二甲苯（30s）-纯二甲苯（30s）-风干一封片一镜检拍照素木精单染法：二甲苯脱蜡至蒸馄水一4%铁矶（20min）—水洗4-5次（5min/per）蒸镭水数次（2-3min/per）—0.5%苏木精（30inin）-*水洗去余色-*2%铁矶分色流水冲洗（30-60min）-50%酒精（2h）->70%酒精（lh）-85%酒精（2h）->95%酒精（20s）->100%酒精

6、（l-5s）-100%酒精（5s）-1/2酒精+1/2二甲苯（5s）-二甲苯（5s）—二甲苯（5s）一通风橱风干一中性树胶封片一镜检番红（safranin）染色液：碱性染料，染木化、角化、栓化细胞壁及染色体、核仁等。（1）番红水溶液：配方：番红1g;蒸镭水100ml用于临时制片染色，可使木质化、栓质化的细胞壁及细胞核染成红色。（2）番红酒精溶液：配方:番红0.5g或lg；50%酒精100ml在植物永久制片中常与固绿、亮绿、苯胺蓝做二重染色，或与结晶紫、橘红G三重染色,可使木质化、角质化、栓质化的细胞壁及细胞核等呈

7、现不同程度的红色，效果甚好。固绿（fastgreen）染色液：乂名快绿。酸性染料，使纤维素细胞壁和细胞质呈蓝绿色。染色快，通常10〜30s即可，不易褪色。配方：固绿0.5〜1g；95%乙醇100ml番红-固绿对染效果：根、茎、叶等组织切片染色后，番红使细胞核、木质化细胞壁呈鲜红色，角质化细胞壁呈透明粉红色，木栓化壁呈褐红色；固绿使细胞质和具纤维素的细胞壁呈蓝绿色。苏木精（hematoxylin）染色液：天然染料，提取自苏木的心材。经其染色，因细胞中结构的不同而呈现不同深浅颜色一一“多色性”，但由于苏木精与组织亲和

8、力差，染色时需加金属盐媒染（如铁矶）。配方（铁矶-苏木精）：甲液：苏木精0.5g；蒸馅水100ml乙液：硫酸铁銭（铁矶）2〜4g；蒸饰水100ml可进行细胞学、胚胎学染色，使细胞分裂时期的染色体呈深蓝色，细胞质呈浅蓝色，细胞壁介于二者之间。色泽保持反久。二树脂包埋切片制作树脂包埋切片原用于电镜切片，20世纪50年代始用于光镜切片，树脂包埋的组织块硬度高，可切出50-80A