金黄色葡萄球菌的测定

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1、金黄色葡萄球菌的测定1卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。2检验方法2.1术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。2.2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。（2）冰箱：2℃～5℃。（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。（4）天平：感量0.1g。（5）无菌吸管：1mL（

2、具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。（7）无菌培养皿：直径90mm。（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.3培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6

3、H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。（3）脑心浸出液肉汤(BHI)1）成分：胰蛋白质胨：10.0g；氯化钠：5.0g；磷酸氢二钠（K2HPO4）：2.5g；葡萄糖：

4、2.0g；牛心浸出液：500mL；pH：7.4±0.2；2）制法：加热溶解，调节pH，分装16mm×160mm试管，每管5mL置121℃，15min灭菌。（4）磷酸盐缓冲液1）成分：磷酸二氢钾（KH2PO4）：34.0g；蒸馏水：500mL；pH：7.2；2）制法：贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。（5）革兰氏染色液①结晶紫染色液1）成分：

5、结晶紫：1.0g；95％乙醇：20.0mL；1％草酸铵水溶液：80.0mL；2）制法：将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。②革兰氏碘液1）成分：碘：1.0g；碘化钾：2.0g；蒸馏水：300mL；2）制法：将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。③沙黄复染液1）成分：沙黄：0.25g；95％乙醇：10.0mL；蒸馏水：90.0mL2）制法：将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。④染色法1)涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。2)滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。3）滴加95％乙醇脱色15s～

6、30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。4)滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。（6）无菌生理盐水1）成分：氯化钠：8.5g；蒸馏水：1000mL；2）制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。2.4检验程序2.5操作步骤（1）样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品

7、为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。（2）增菌和分离培养1）将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。2）将上述培养物，分别划线接种到B-P平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h～24h。B-P平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。3）金黄色葡萄球菌在B-P平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触

8、菌落有似奶