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1、项目类型项目编号201303094福建省农业科学院科研项目季度研究报告木糖异构酶组成型表达酿酒酵母重组菌株的构建项目类型：公益性行业（农业》科研专项项目名称：功能性微生物制剂在农产品加工业副产物资源转化与利用中的研究与应用承担单位：中国农业科学院作物科学研究所作者姓名：王智通讯作者：顿宝庆联系电话：13651398539电子邮箱：wangzhi@caas.cn,dunbaoqing@caas.cn福建省农业科学院2013年9月摘要11、项目背景12、研究概述23、材料与方法24、结果与分析95、讨论116、参考文献137、知识产权158、致谢15木糖异
2、构酶组成型表达酿酒酵母重组菌株的构建作者：王智通讯作者：顿宝庆单位：中国农业科学院作物科学研究所摘要木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于衙萄糖的单糖，木糖乙醇发酵是决定木质纤维素类物质生产燃料乙醇具有经济可行性的关键因素之一。本实验成功的在酿酒酵母胞内表达拟南芥木糖界构酶并获得活性，以葡萄糖和木糖(2:1,w/w)为混合碳源进行培养，在酿酒酵母常规培养温度3O°C木糖异构酶酶活测定在O.5U/mg总蛋白以上，为构建葡萄糖和木糖共发酵乙醇工程酵母打下了基础。1V项目背景能源短缺、环境污染与全球变暖是目前全世界共同面临的重大问题。因此，世界各国纷纷积极开展新
3、能源、可再生生物质能的研究与开发，其中以燃料乙醇的研究开发最为成功,是最为可能的替代能源之一(Farrell,etal.,2006;Hahn-Hagerdal,etal.,2006)□我国能源形势更加严峻，据报道，按冃前探明储量我国石油可经济开采年限不超过20年。国家有关部门表示，2012年中国石油对外依存度已达到58%,据《全国矿产资源规划(2008・2015)》预测，如不加强勘察和转变经济发展方式，到2020年中国石油对外依存度将上升至60%o石油安全已经成为影响国家安全的重要因素，解决能源替代问题成为关乎国民经济可持续发展的战略问题。冃前燃料乙醇
4、已在我国10省区使用，全省封闭推广6省(黑龙江、吉林、辽宁、安徽、河南、广西)，局部推广4省(河北、江苏、山东、湖北)，可以看出其应用前景之广阔(路明和王思强,2010)o用于生产燃料乙醇的原料有淀粉类、糖类或纤维类。目前，我国主要以玉米、小麦等已转化的淀粉类粮食为原料生产燃料乙醇。我国人口众多，土地资源相对贫乏，用粮食生产乙醇只能作为粮食安全系统屮的调解器，发展规模有限。而潜力巨大、资源丰富、价格低廉的农作物秸秆类纤维素物质尚未得到有效开发利用。我国年产秸秆和其他农产品废弃物达7亿吨以上，尚有大量边际土地可用于发展能源作物，资源总量预计在10亿吨以上
5、，除去维持土壤肥力和防止土壤侵蚀所必需的还田以及作为饲料部分外，至少有4亿吨可用于开发秸秆乙醇，按6吨秸秆产1吨乙醇计算，每年可产燃料乙醇6600万吨以上(路明和王思强,2010)。6600万吨乙醇,相当于2011年汽油消耗总量的88%。与第一代生物乙醇燃料相比，纤维素乙醇的原料来源更加广泛。但是，与富含淀粉质的原料相比，秸秆类纤维素物质具有木质纤维复合物结构，难以直接发酵生成乙醇。木质纤维素的组成和结构非常复杂，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成(分别约占干质量的45%、30%和25%)(Rubin,2008)0目前纤维素乙醇生产的难点与关键点(Ru
6、bin,2008;陈洪章和邱卫华,2007)主要有:①木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高；②缺乏高效的产纤维素酶菌株，现有的纤维素酶制剂效果较低，使得酶解糖化经济成本较高；③缺乏能够同时高效代谢五碳糖和六碳糖的发酵菌株，五碳糖特别是木糖的利用是影响纤维素乙醇综合成本的关键因素之一。半纤维素构成了秸秆类纤维素物质中的相当部分，约为30%,其水解产物是以D-木糖为主的五碳糖，如果能够有效地将木糖发酵为乙醇，能使秸秆类纤维素乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25%(Kurtman,1994),纤维乙醇生产成本将会降低20%左右(Angspannefore
7、ningen,1994)。所以木糖发酵产乙醇己成为决定秸秆类纤维素物质牛产乙醇的经济可行的关键因素之一(Wooley,1999)。2、研究概述酿酒酵母是工业上乙醇发酵的首选冃标微生物，具有许多特性如厌氧条件下生长良好，较高的乙醇产率以及对一些木质纤维素水解物中的生长抑制因子如乙酸、糠醛等具有较高的抗性(Rubin,2008;vanHoek,etal.,2000;Visser,etal.,1990)。此外，酿酒酵母全序列已测定，遗传操作技术也已经成熟。但大多数工业酿酒酵母菌株不能代谢木糖，原因是其没有专一性转化D・木糖为D■木酮糖的酶系。木糖异构酶(XI
8、,EC5.3.1.5)是在体内催化D・木糖到D・木酮糖的可逆异构化的酶。由于木糖异构酶直接完成
