20栽培稻种中杂草稻混杂检测规程02

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1、ICS65.020.20B22备案号：DB32江苏省地方标准DB32/TXXXX—2018栽培稻种中杂草稻检测规程TestingregulationsofWeedyRiceinCultivatedRicc，sSeed2018-XX-XX发布2018-XX-XX实施江苏省质量技术监督局前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14检测前准备工作25操作步骤26结果统计3附录A（规范性附录）普通PCR方法6本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主

2、要起草人：强胜、戴伟民、宋小玲。栽培稻种中杂草稻检测规程1范围本标准规定了杂草稻的术语和定义、试剂配制、仪器和用具、照明要求、样品制备、操作步骤、结果计算等方面的内容。本标准适用于栽培稻稻种中杂草稻的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5491粮食、油料检验打-样、分样法GB/T22505粮油检验感官检验环境照明3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1杂草稻weedyrice杂草稻(weedyrice)是指在水稻FH中

3、可以自我繁衍具有杂草特性的水稻(OryzasativaL.)物种。3.2纯合体的杂草稻homozygoticweedyrice栽培稻种子中具有红果皮的杂草稻。3.3杂合体的杂草稻heterozygousweedyrice杂草稻的花粉飘逸到栽培稻柱头上发生杂交，产生的栽培稻种子(2n=24条染色体)中含有杂草稻的一半染色体(n二12条染色体)，但果皮色依然表现为白色。称为杂草稻杂合体。其种植到田里开花结果，就会产生性状分离，产生具有红色果皮的杂草稻种子。3.4Rc基因RcgeneRc基因是水稻果皮原花色素积累途径屮最重要的调节基因位于第7染色体上,全长约6.4kb,包含

4、有&个外显子，产物为一个具有碱性螺旋■环■螺旋(bHLH)元件的调节蛋白。Rc基因具有比rc基因多14bp插入/缺失，从而设计特异性14bp插入/缺失引物进行PCR扩增，以检测杂合体杂草稻。4检测前准备工作4.1试剂配制聚丙烯酰胺母液（40%）:按19:1的比例将38g丙烯酰胺和2g甲叉双丙烯酰胺加入100ml去离子水屮，待溶解后定容，于4°C冰箱屮储存备用。5xTBE电泳缓冲液1L（母液）：54gTrisbase,27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA（pH8.0）,加蒸饱水至IL。10%过硫酸钱：1g过硫酸鞍溶于10ml蒸懈水中，4°C冰箱中保存1周左右。4（）

5、OmLNaOH溶液：6g氢氧化钠，0.076g四硼酸钠，1.6ml甲醛（甲醛应放入冰箱中，易变性）,加蒸镭水至400ml,现配现用。0.1%AgNO3：取0」gAgNO3溶解于100ml蒸锢水中，现配现用。4.2仪器和用具稻谷检验出糙机、电动研磨机、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪、照相机。3.3照明要求操作过程中照明条件应符合GB/T22505的要求。4.4样品制备纯合体杂草稻检测取样按GB5491-1985执行。上述纯合体杂草稻检测后，去除红色糙米，然后将白色糙米按GB5491-1985中3」的规定混匀。将样品倒在光滑平坦的桌面上或玻璃板上，用两块分样板将样品摊成正方

6、形，然后从样品左右两边铲起样品约10cm高，对准屮心同时倒落，再换一个方向同样操作（中心点不变），如此反复混合4次〜5次，将样品摊成等厚的正方形。取50份，每份200粒糙米。5操作步骤5.1纯合体杂草稻检测使用稻谷检验出糙机脫壳，查看糙米的颜色，分别计数糙米总数（m）和红色糙米数（ml）。5.2杂合体杂草稻检测5.2.1磨粉用电动研磨机将200粒白色糙米碾磨成粉，混合均匀，取4份，各30mg。5.2.2DNA提取采用适于提取水稻及其产品DNA的试剂盒方法，进行DNA提取。制备DNA模板吋设置不加任何试样的空白对照。5.2.3DNA溶液纯度测定和保存将DNA溶液适当稀释

7、，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率,OD260值应该在0.05〜1的区间内，OD260nm/OD280nm比值应介于1.4〜2.0之间，根据OD260值计算DNA浓度。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25ng/uL,-20°C保存备用。5.2.4PCR反应和跑胶见附录A。记录杂合条带的胶孔数（n）o6结果统计6.1纯合体杂草稻检验结果计算纯合体杂草稻含量（M）以质量分数（％）表示，按式（1）计算：M=（mi/m）x100式中：mi……糙米屮红色糙米的粒数，单位为粒m——糙米的总粒数，单位为粒。在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，