感受态细胞制备(三种方法)

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1、方案23制备和转化感受态大岛抨商的H.anahan方法:高效的转化策略•87•方案23制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法:高效的转化策略20世纪70年代晚期和80年代早期，00吨Hanahan在玲泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前从未昕说过的转化效率，并且在以后他的方法被标准化了。Hanahan开一辆快车，而且总是带有神秘感地在夜里工作，他从来讲过给他带来神奇结果的缓冲液的成分。然而.他无偿和慷慨地把这种缓冲液提供给了需要进行高效转化实验的每一个人。在东海岸80年代早期产生的许多质量上乘的cDNA文库都是用Hana.han的缓冲液构建的。Hanahan的缓冲液闪烁着

2、美丽的色彩因而以"液体黄金"闻名。最终，掖悻黄金的配方发表了，而且带有如何实现高效转化的详细说明(Hanahan1983)。如果做得很细心，用Hanahan的方法可以重复性很好地制备出效率很高的大腼抨8菌感受态细胞(5)(10个转化菌/阅超螺旋质桂DNA)。这里关键是仔细，严格准确地按照Hanahan的指导一切都将收利。取捷径，用不净的容棉、不纯的水或陈旧的试剂那肯定要失败。这也许可以解释.为什么某些研究者总是不能重复出Hanahan的结果。有三个关键因素是采用Hanahan方法并按得与其一致的高效转化率必须注意的;·所周转化缓冲淡的试剂能皮用高纯度的水和二审亚飘(DMω)制备庸受态细胞是

3、最重要的(Hanahan1985)，包括细菌培养基成分在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。无论何时，尽可能使用新买的试剂和生长培养基。如出现问题，每→种试剂，如DMSO、DTI、甘油、MES等，应逐一在转化操作中予以替换，以查明某一批号试剂的质量以及对转化效率的影响。·细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于一70t:的储备菌中直接培养获得的，因此，不应使用在实验室中连续传代或存放于4t或室温的培养物。·玻h岛和塑耕嚣皿的清洁微量的洗搔剂或其他化学物质舍大幅度地降低细胞转化妓率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应

4、用手来刷挠，并且用纯水(Mini-Q水戎相当的水)充满，再经高温高压消毒。水在玻璃器皿使用前应倒掉。注意:很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗襟剂的。Han血m方法适用于很多分子克隆中常用的大腼抨菌.如DH1，DHS、MM294、JMI08/109、DH缸，还有很多其他的株系。但也有一些株系的大肠杆菌(如MCI061)不能采用这个方法，有关的细节以及这个方法如何用于其他细菌，见Hanahan等(1991,1995)。转化的其他方法将在方案24(超级感受牵细胞的制备)和方案25(氟化钙的转化方法)中介绍。.88•第1章质植及其在分子克隆巾的应用材料注意=对于标记

5、(!)的试剂的操作，请参且硝录12.缓冲液和溶液贮带液、..冲液鞠试剂成分清见附录1.应用时串串贮存穰稀释至适当浓度.二甲亚枫DM目)(0二甲亚鼠的氧化产物据推测为工甲幢幢，是转化的抑制衡，阳山培班(DMSO和U口)旷盯〈二撞苏糖醇)1.53gDMSO9ml1mol/L乙艘'甲(pH7.5)100μH]O补歪10皿1DnD糟被周可耐受有机榕剂的M泊阻SR膜(Milli阳时过lJl除菌，将岛D糟被分装成1ωμi小份放入0.5ml的元菌微量离心管中.曹封管口，贮存于-20'C.转化缓冲玻(请见步.1)标准的转化侵棉被(TFB)一般现用现配。冻存的缓冲液(F回)周末E库存(-70t)感受牵细胞e

6、培养基SOB琼脂板含20tnmol/LMgSO"和适量的抗菌素标准的国B琼ø~-ti含10m皿ol/LMg剑)4050S培养基舍20mmoVLMgS04标准的SOB培养基含10mmo1ILMgS040S倪培养基每次转化反应需1ml的叹兀培养墓。核酸和寡核昔酸质粒DNA(重组质粒)2蓝本章1f*17-22所提供的方法梅..离心机和转头SorvallGSA转头或与之相当的转头专用设备液氮<0方案23制备和转化.曼在大肠杆菌的H.e.nahan方法τ离放的转化策略•89.预冷的果丙烯离心管(50ml)预冷的聚丙烯离心管(17XlOOmm,Fal∞m2059)预置的42'c水浴载体和菌种冻存的做转

7、化用的大肠杆菌t蓝酋种精在-70'c下保持{见附录1、的。方法重要:*方案申的所有步骤均应在无菌条件下进行。细胞的制备1.转化缓冲糟的准备若制备立即使用的感受态细胞可用TFB.着制备贮存于-70t的感受态细胞则用F钮，来自配制转化缓冲撞的水的有机'自污集会降低，受态细跑的章'化E恨。因此.采用直接从质量很好的Mi囱.Q过法系统(Míllipore)取得的水将会得到满意的结果e假如出现问窟，使用前可用活性>>t处理去离子水