资源描述：
《PCR发展历程综述》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、PCR技术发展历程综述摘要：PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。本文简要叙述了PCR技术的发展历程及现在所发展起来的相关技术。关键词：PCR技术变性退火延伸1.PCR技术的发展简史1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定D
2、NA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功，1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者。但当时Mullis所使用的大肠杆菌
3、聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：Klenow酶不耐热，在对DNA模板进行热变性时，会导致此酶的钝化，因此需要每完成一个扩增周期增加一次酶。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，提高扩增DNA片段的均一性，1988年Saiki等从温泉中分离的一种水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。现已被广泛应用于农学、植物病理学、生物学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术
4、被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断。短短几十年，该技术已经成为最常用也最重要的分子生物学技术之一，其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等，甚至扩展到许多非生物领域。2.PCR技术的原理PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列（模板）在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件
5、下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以
6、及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。3.PCR技术进步关键3.1热循环仪市场上有众多的产品,在质量和技术上首推PE及MJreasearch。总的发展趋势是1)无油操作,要求的反应体积小,PE2400可做小至5uL的反应;2)升降温速度快,PE9700可达到3.5℃/s,温控精度及静态样品温度均衡性高,这一点是通过控制反应管内的温度,而非加热块的温度来实现的;3)界面友好,操作灵活,显示直观,允许多用户。此外,还有几种特殊用途的PCR仪:大容量PCR仪,TheTetrad(MJRese
7、arch)可同时做1536个反应,适合于高通量实验室的要求;实时定量PCR,ABIPRISMTM5700(PE)能对PCR过程做到实时定量监控,闭管操作,无污染,无须扩增后处理;梯度PCR仪,例如,Eppendorf的产品,可在一个反应槽内,一次实验当中快速地测定最佳变性温度和退火温度,节省时间,减轻实验强度;PCR仪的加热部分和控制部分分离,RemoteAlphaDockTMSystem(RADMJResearch)的这两部分可以分开远达3m节省实验室空间,便于进行自动化操作。同时有多种形式的加热部分可供选择,可以满足不同的要求。3.
8、2引物设计与合成引物的设计可通过计算机和网络来实现。网上有许多提供免费在线引物设计服务的网址和软件，例如在线版的Primer3.0，以及Primer5.0等软件，设计好的引物则完全由专业公司来合成,合成的引
