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1、肝脏细胞的分离、培养和鉴定技术摘要：随着分子生物学，细胞工程学，细胞免疫学的快速发展，人们亟待解决各类细胞的分离、培养与鉴定技术，肝细胞分离、培养是一种研究肝脏和肝细胞的良好方法，从阳来促进学科的发展。而对于水生生物的鱼类一样，需要各类细胞的分离培养鉴定技术，而肝细胞就是其中一种。将其技术做简单概述。关键词：鱼类肝细胞；分离；培养；鉴定离体培养鱼类肝细胞是一种可以模仿体内肝脏活动的简单系统，弄清楚其机理，从而广泛应用于人类，如肝病机理、药物代谢牛物人工肝系统、牛物化学、致癌研究等爆发性肝炎和慢性肝病晚期的病人病情重，在临床上是临床可以促进医学的发展。一、肝细
2、胞分离方法血类的细胞分离也如同其他的哺乳动物类似，参考-其他哺乳动物來分离，只是有些特殊细胞需耍特殊处理。1•机械分离法(1)直接剪切法1961年,Hillis等最早进行了人胚肝细胞培养。将手术収得的肝组织切成小块，直接置于简单培养液中即可。此方法操作简单,成本低，所分离的细胞膜1二的蛋白质成分性质不易改变。但外植块上长出的上皮细胞时间长，各部分间不均一,获得的肝细胞数量也有限。成纤维细胞也会迅速增殖，在其增殖与分化的过程中，与肝实质细胞形态和似，不易区分，从而难以观察肝细胞的数II和生长、分化程度。此外，未分化的细胞在培养过程中其分化及功能的获得与正常肝细
3、胞有一定差界，因而此法显得比较局限。此法在取鱼组织细胞吋常用。(2)剪切消化法此法将肝脏直接分离證于冷的培养基屮，剪碎，加人溶解的酶多为胰酶或胶原酶破坏肝细胞间的连接，再经震荡、沉淀，最后在上清液中得到游离的肝细胞悬液。此法操作简单,在成年肝与胎肝中均冇采用，仅在酶的浓度和消化时间上冇细微的差别。一些实验室采用该法，用于肝细胞功能和对外界的反应等少部分研究，但何许多不足之处。若采用成年鼠肝脏由于成年的肝组织连接多而紧密，分离困难，刀剪的机械损,使得细小组织块周围的肝细胞多受损，不易成活消化时，中心的细胞耒分离，周边的常消化过分而被破坏。若用胚肝培养时,又有细
4、胞未分化的缺点,成纤维细胞人量增生。此外，细胞多呈团块,混有人量血细胞。在鱼类屮最为常用。2.门静脉灌流消化法分离肝细胞的关键是破坏细胞Z间的紧密连接，以获得实质细胞。等首创用胶原齣和透明质酸陆共同灌流肝脏，提高了分离的肝细胞的存活率。以后，乂发现胶原陆也可消化、分解大白鼠胎肝以及人胚肝。此法不断被改进及应用，将分离的肝细胞存活率捉高到了80%o1971年，williams,等建立了用胶原酶、联合灌流分散肝细胞的方法。许多学者也随后进行了研究,Segalen首先将EDTA先灌流过川:脏，后用胶原酶分离川:连接，形成了经典的门静脉二步灌流法。现在，各种肝脏灌流
5、的基本方法多为先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离了，再换含蛋白水解酶的溶液至组织软化即可。近來文献表明，肝灌流的途径除了门静脉外,还有经胆道、腹主动脉等多种途径。此法分离、获得的肝细胞儿乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，而且保留了肝细胞的各种功能。并且，细胞的形态易于观察,单一性较好,便于各种处理和观察。还冇活性高，容易培养的优点,作为肝细胞培养的经典方法，被广泛于肝毒性物质的筛选，肝脏的各项功能的测定与调节，以及护肝药的活性鉴定和机理分析,肝炎病毒的感染和转导等多方面。但山于操作环节多，技术要求高，所费的时间长，故易污染。加强严格的无菌操作，
6、在培养基中加入抗牛素,可减少污染的可能。2.肝细胞亚群的分离技术肝细胞有着不同的作用,在研究屮需要将其分离分别培养以研究各白的功用。离心分离法根据不同肝细胞亚群Z间的形态、大小和密度的不同而将各口分离,其包括简单的速度沉析到复杂的多种密度梯度离心法。其中等介绍的不连续密度梯度离心法提高了细胞的产量和纯度是简单冇效的实验方法O选择性私附分离法利用细胞选择性的豁附到固体表面如组织培养皿上的特性从而分离特殊的川:脏细胞O枯否氏细胞首先戮附到固体表面可冇效地将其从内皮细胞和其他肝脏细胞相中分离O此方法简单、方便、成本低叫。双相水聚合物提取法由两种水溶性聚合物最常用的
7、是葡聚糊和聚乙二醉按一定比例混合形成等渗压的双相液体系统根据电荷密度、疏水性和免疫性能的不同而选择性进入不同的液相从而将不同川：细胞分离O但此法得到的细胞活性较低'川选择性细胞毒分离法通常利用蛋白水解廨如链霉蛋白酶、胰蛋白酶和内毒索等引起肝细胞选择性溶解从而使肝实质细胞与非实质细胞分离利用仪器鉴别法荧光激活细胞分类仪可以将荧光标记的细胞通过流式细胞技术检测分离岀来于肝脏不同亚群的定性和纯度分析能通过细胞的细微差异如细胞表面微小的电荷差别的细胞亚述可以区分完整的活细胞与死亡的细胞、细胞核利细胞碎片O但均因细胞产量相对低时间长并且设备昂贵实际应用较少肝细胞培养方
8、法铺板胶质培养最初等人将获得的细胞或组织块直接置于铺
