可注射聚丙交酯多孔微载体制备及骨髓基质干细胞培养研究

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1、可注射聚丙交酯多孔微载体制备及骨髓基质干细胞培养研究王瞰，全大萍*（中山大学化学与化学工程学院高分子材料研究所，广州510275）摘要：采用双乳化溶剂挥发技术制备聚丙交酯（PDLLA）多孔微载体，通过改变内水相中碳酸©钗溶液浓度，调节微载体的孔径和孔隙率，并研究了微载体的制备条件対其粒径和形貌的影响。SEM观察及粒度分析显示：微载体具有表面开孔、内部相互连通的孔结构，粒径在335±65nm范围内，内部孔径20um左右，孔隙率达80%以上。休外细胞培养显示骨髓基质干细胞在微载体表而及内部能有效黏附并均匀生长。由此提示

2、：相对于实心微球，这种表面和内部具冇多孔结构的微载体更冇利于细胞的黏附和生长，并可通过注射方式将细胞运载到组织缺损部位以促进组织修复和再牛。关键词：聚丙交酯，多孔微载体，双乳化溶剂挥发技术，可注射，骨髓基质干细胞1前言组织工程支架通常采用体外预制成型支架⑴，一种可通过注射成型的组织工程支架目前受到特别的关注。町注射成型支架由于可通过微创手术植入体内，在一些特殊部位如脑纽织损伤修复、骨组织、关节软骨等不规则缺损方而的修复有着非常重要的应用价值。可注射组织工程支架冃前大多采用水凝胶卫⑶，而多孔微载体是近年发展起来的-•

3、种新型用于细胞培养和传输的町注射组织工程支架。细胞微载体通常冇两种形式：实心微球（讪和微包囊⑹，前者细胞只能黏附在微球表面,后者必须将细胞包裹在微球内部，存在的主要问题是细胞黏附的表面积有限，而微囊包裹不利于细胞的繁殖和生长。因此，制备表面开孔、内部具有多孔结构的微球载体由于比表面积增加，将冇利于黏附更多的细胞，开孔结构冇利于营养物质的传输和细胞的生K。韩国以碳酸氢钱为制孔剂通过双乳化技术制备PLGA微球，通过盐的分解发泡技术可得到表面和内部均貝有多孔结构的微载体⑺。KWChun等报道以单乳化化技术制备了PLGA实

4、心微球，并研究了表面分别具有疏水性、带负电性和带正电性对细胞黏附的影响役由此说明，控制微载体表而和内部的孔结构，以及修饰微载体的表而可以在一定程度上调控细胞的黏附和生长，这方而的工作文献报道并不多。本文以改进的双乳化■溶剂挥发技术制备出一种新型的可降解吸收微载体，探索制备微载体的工艺参数对其粒径、孔径、孔隙率的影响，并通过骨髓基质干细胞在微载体表面和内部的黏附与牛长评价这种微载体在纽织工程屮的应用价值。2实验部分2.1材料聚丙交酯（PDLLA）本实验室合成（Mn=16.1x104）；聚乙烯醇（PVA）：进口分装（M

5、w基金项目中山大学化学与化工学院第六届创新化学实验基金项目（批准号：200629）资助第一作者王II敦（1983年出生），女，中山大学化学与化学工程学院化学工程与工艺专业2002级联系人全人萍（导师）Email：cesqdp@zsu.edu.cn300~500）；碳酸氢钱（分析纯，天津大茂化学试剂厂）;pH7・4磷酸缓冲生理盐水（PBS）（分别称取1.636gNaCl,0.040gKC1,0.716gNa2HP0t,0.049gKH2PO4溶解于蒸馆水中,定容至200mL）；其它试剂均为分析纯。2.2微载体制备采用

6、双乳化■溶剂挥发技术制备：将2.5mL不同浓度碳酸氢钱水溶液滴加入15mL浓度为0.33g/mL的PDLLA二氯「卩烷溶液中，超声均化分散lmin,形成初乳液。将上述初乳液滴加入1OOmL浓度为1%PVA的外水相，滴加完毕，立即将此溶液倾入300mL浓度为0.1%PVA溶液。上述W/O/W型乳液在300r/min下挥发溶剂4h,挥发充分后过滤，用去离子水反复洗涤2〜3次，以除去微球表面的PVAo冷冻干燥后置于干燥器中保存。改变各条件参数，制备系列微球。2.3微载体性质研究采用Mastersizer2000激光动态粒

7、度分析仪测定微载体粒径；采用徳国JSM-6330F场发射扫描电子显微镜观察微球形貌。微载体含水率测定：干燥微球先用70%的乙醇浸润，再用去离了水洗三次，然后在磷酸缓冲溶液屮浸泡12h,称重。含水率通过下式计算：Wateruptakeratio=（IVW・VVd）/VVw其中Wv和Wd分别是含水微球和T燥微球的重量。2.4细胞培养细胞：大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）。取100mg微载体经75%乙醇浸泡半小时后，用培养基冲洗若干次。将微球投入细胞培养瓶屮，于50mL/LCO2细胞培养箱（37°C、饱和湿度）培养，4

8、8〜72小时培养后换液以去除非粘附细胞，以后每周换液2次。细胞培养27天后，置于CK2型（OLYMPAS,FI本）倒置相差光学显微镜下观察细胞牛长情况。微球离心分离后用戊二醛浸泡过夜，再用PBS溶液洗涤6次，样品川液氮冷冻示冷冻干燥。扫描电镜观察细胞黏附情况。3结果与讨论3.1影响PDLLA多孔微载体粒径的因素分析实验屮发现聚合物浓度、聚合物分子量、有机相和