资源描述：
《双重PCR诊断棘阿米巴角膜炎研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、温州医学院硕士学位论文双重PCR诊断棘阿米巴角膜炎研究姓名:秦茜申请学位级别:硕士专业:临床检验诊断学指导教师:潘长旺;梁韶辉20071101温州医学院硕止学位论文双重PCR诊断棘阿米巴角膜炎研究温州医学院检验医学院研究生：秦茜导师：潘长旺教授梁韶晖教授陶志华教授中文摘要目的：棘阿米巴角膜炎（AK）是一种致盲率极高的慢性进行性角膜炎。由于发病早期常缺乏特界性临床表现、诊断方法欠敏感、特异性低，故常导致误诊、漏诊、误治。本研究采用分子生物技术双重PCR（multiplexPCR）,
2、n）时扩增棘阿米巴18srDNA和26srDNA基因片段，旨在探索一
3、•种快捷，方便，特异性、敏感性均高的早期诊断棘阿米巴角膜炎的方法。方法:1.棘阿米巴的培养和形态学研究:对延边医学院提供的三种己知基因序列的棘阿米巴（Acanthamoebasp.CJY//s基因型、CJY//s2基因型和Neff基因型）fflPYG培养液培养、保种，并用革兰氏染色进行滋养体和包囊的形态学观察。2.PCR及双重PCR扩增棘阿米巴18SrDNA和（或）26SrDNA基因方法学的建立。3.棘阿米巴的动物（兔子）模型建立及双重PCR应用:用CYL//S2基因型棘阿米巴PYG悬浊液注射兔子左眼角膜基质层,使兔子感染棘阿米巴引起角膜炎;右眼做
4、为对照，建立棘阿米巴角膜炎动物模型。观察兔子左、右眼变化。用双重PCR检测兔子两眼分泌物、眼冲洗液、眼角膜刮片及眼角膜活检组织。兔子两眼角膜病理切片并DE染色观察棘阿米巴滋养体及包囊的形态。4.双重PCR法和无营养琼脂培养法检测:83例在校大学生无症状隐形眼镜配戴者保存盒内镜片放置过夜的液体、40例未曾使用过的隐形眼镜护理液、42例疑似棘阿米巴角膜炎患者眼分泌物及58例正常人眼分泌物。澀觸医学院舔j：学缱论文结果：1。三种不网基因型棘阿米巴肉眼观察，形态上没有多大差开。但据延边医学院提供的基因痔列，可知Acanthamoebasp.CJY〃s株和C
5、JY//s2株同属T4基因型,A.castellaniiNeff属于Neff型。Acanthamoebasp.CJY//s和Neff株具有99%横同碱基。Gram染色后，镜下清晰可见包囊双层囊壁结构，亮圈状。滋养体形态较难形容,但可以清楚看见其内含的食物泡和细胞核。2,PCR反映俸系共30塾王。其中含模板DNA5黏王，引物（5瑟mol//L）2®王,Taq酶（1.5U//nl）0.3uL反???参数如下:94°C5min,94°C40s,复性温度40s,72°C45s。共35个循环，最后2°C5min0曲于引物不同，复性温度值也不同。引物Q〜1、J
6、DP和FT对应的复性温度值分别为50°C、55°C和61°C,双重PCR的复性温度值为60°Co单一PCR扩增三种棘阿米巴虫株18SrDNA,JDP和Q・1引物均扩增&分子量大小为463bp和188bp的特定扩增带。单一PCR扩增三种棘阿米巴虫株26SrDNA,Acanthamoebasp。CJY//s2株和矗。castellaniiNeff株的26S核糖体DNA基因片段扩増出分子量大小为126bp的特定扩増带，而Acanthamoebasp.CJY//s株未得到预期的扩增带。双重PCR同时扩增三种不同基因型棘阿米巴、大肠眷于菌、流感病毒的18Sr
7、DNA和26SrDNA基因。Acanthamoebasp.CJY//s2株和A.castellaniiNeff株中分别扩增出分子量大小为463bp和126bp的特定扩增带。而Acanthamoebasp.CJY//s株仅扩增如分子量大小为463bp的特眾扩增带。大肠杆菌和流感病毒未有扩增出任何条带,说明该检测方法具有离特异性。PCR检测棘阿米巴灵嫩度为8个痫原。3.双重PCR检测兔了左眼分泌物、眼冲洗液、眼角膜刮片和眼活检角膜组织提取斡核酸中均扩增毒分了量大小为463bp和126bp的特定扩增带;右眼四种物质均未扩增出任何条带。兔子角膜病理切片｝｛
8、〔染色后镜下可见：兔子右§蕤（对照组）角膜组织结构清楚，兔子左眼（实验组）上皮细胞层、前弹力层溃破，人量炎性???胞浸润。上皮细胞层中看见棘阿米巴包囊，基质层内看见棘阿米巴滋养体。4•双重PCR检测结果:83例隐形眼镜保存盒内液体,阳性1例，经核实该病人曾经患有棘阿米巴角膜炎，药物治疗后好转;40例耒曾使用过的隐形眼镜护理液均为翻性;42例疑似病人眼分泌物，阳性2例,其中王人为隐形眼镜配戴者,1人曾有角膜外伤史;58例正常人眼分泌物均为阴性。琼脂培养结果:123侧隐形眼镜傑存盒内液体均阴性;42钏疑似病人眼分泌物，阳性2例，即为双重PCR检测阳性患
9、者;58例正常人眼分泌物均为阴性。检测是否感染棘阿米巴的”金标准”到垦前为止是培养病原阳性。但结合病史，双重PCR的阳性检
