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1、桂林地区乙肝患者HBVB基因亚型分布探究摘要：目的：研究桂林地区乙肝患者HBVB基因亚型分布特点，为本地区乙型肝炎的防治提供依据。方法：采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因，经测序后与标准序列比对，采用Mega5.0构建系统树进行基因亚型分型。结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型，序列分型B2104例，占86.7%；B41例，占0.8%；B51例，占0.8%,其中14例未分出亚型，占11.7%o结论：桂林地区HBVB基因亚型主要以B2为主，其次为B4、B5,未发现Bl、B
2、3、B6亚型。关键词：乙型肝炎病毒；S基因；B基因亚型；分布中图分类号：R512.6文献标志码：A文章编号：1008—2409(2012)04—0471—03HBV基因型/亚型的分布具有明显的种族和地域性差异，以往的研究表明我国主要以B和C基因型感染为主，且北方以C基因型为主，南方以B基因型为主，且HBV基因亚型也呈现出一定的地域分布。广西是乙型肝炎高发地区，目前发病状况仍未得到有效控制，且桂林地区HBV基因亚型的分布概况尚无文献报道。HBV基因亚型可能与病毒感染途径、基因突变、疾病进程和抗病毒疗效有一定
3、关系。因此，基因亚型分型对乙肝病毒变异的研究、发病机制的探讨、病情评估、治疗药物的选择和预后判定，以及分子流行病学研究具有重要的意义。目前，HBV全基因序列分析是基因分型的金标准。由于全基因序列分析比较复杂，国内外通常用S区序列来替代全基因序列分析。本研究通过S基因序列分析方式研究桂林地区HBVB基因亚型的分布概况，以期为广西乙型肝炎的防治提供理论依据。1材料与方法1.1主要试剂病毒DNA提取剂DNAout、PCR试剂盒均购于四川天泽基因T程有限公司，Pfu酶购于Takara公司，引物由上海生物工程公司合
4、成，PCR产物测序南北京利嘉泰成生物公司完成。1.2研究对象120份经荧光实时定量PCR鉴定为阳性的HBV感染血清均采自广西壮族自治区桂林市第三人民医院门诊和住院患者，患者来自桂林市区及周边12个县。其中男115例，女58例，年龄5〜72岁，患者血清中HBV病毒载量为103〜108copy/ml,诊断为慢性乙型肝炎，诊断均符合我国2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性病毒性肝炎的诊断标准。1.3HBV—DNA提取和扩增从患者血清中提取DNA,操作步骤按照说明书进行，以巢式PCR扩增HBVS基因。第二轮
5、上游引物ATCCGCAGGCCATGCAGTGG(3191—3211bp),下游引物为GTCGTCCGCGGGATTCAGC(1458—1440bp),扩增片段长度为1772bp,包含了678bp的S基因，具体操作见文献。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，送北京利嘉泰成生物公司进行DNA序列测定，并以DNASTAR分析测序结果。1.4HEV基因亚型分型从GenBank上获得乙肝病毒6种B基因亚型(Bl—B6)完整序列，每种基因亚型挑选2条，截取其中的S区作为分型标准序列，与本研究测序所获得的样本
6、以ClustalW比对,Mega5.0分型,最后生成phylogenetictree。2结果2.1HBV基因的扩增及测序120份乙肝患者血清中均扩增出产物，1%的琼脂糖凝胶电泳检测显示，扩增片段为1800bp左右，与预期相符。部分电泳结果如罔lo将扩增产物送测序，每份PCR产物均进行3个测序反应。将所获得序列与GenBank上HBV的序列进行比对证实确为HBVS基因。2.2患者体内HBV的分型用Mega5.0将120份样本HBVS基因序列与16条标准序列比对后生成系统树，120例B批基因亚型中有B2(86
7、.7%)、B4(0.8%)和B5(0.8%),未知亚型(11.7%),未发现其他亚型。3讨论乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的公共卫生问题，全球约20亿人感染过HBV,慢性HBV感染者达3.5亿；全球每年约100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。根据HBV全基因组序列差异28%或S基因序列差异24%,目前将HBV分为9个基因型(A〜I),按照全基因组序列差异＞4%而〈8%,基因型可进一步分为不同的基因亚型。以往的研究表明我国主要以B和C基因型感染为主，且北方以C基因型为主，南方以B基因型
8、为主。笔者的研究也证实了广西桂林地区HBV基因型主要为B型，其次为C型。HBV基因亚型呈现出一定的地域分布：Bl(Bj)主要见于日本，B2(Ba)主要在中国大陆和台湾、东南亚等亚洲国家和地区流行，B3见于印度尼西亚，B4见于越南，B5在菲律宾发现,B6在贝加尔湖发现。有研究报道，不同基因亚型的HBV病毒有不同的生物学特性，如致病力或对抗病毒药物的作用不同等。本研究采用S基因测序的方式对桂林地区乙肝患者体内HBV进行基因亚型分型
