chap08 蛋白质的提取

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1、第8章蛋白质的提取8.1原材料的选择原则8.2细胞破碎和细胞器的分离8.3提取时有生理活性物质的保护措施8.4提取条件的优化8.5蛋白质提取的原则主要内容8.1原材料的选择原则微生物植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，如在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：①利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；②利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物

2、品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，要选择有效成分含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。近年来,由于基因工程的出现,采用微生物作为分离材料的情况越来越多了,例如细菌,酵母细胞等.对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。8.2细胞破碎和细胞器的分离破碎细胞释放细胞内容物的方法很多。根据作用方式不同，基本可以分为两大类：机械法和非机械法。传统的机械法包括匀浆、研磨、压榨、超声等；常见的非机械法包括渗透

3、、酶溶、冻融、化学等；其中一些新的方法也在不断发展和完善，如激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等。每一种方法都有它的适用范围及优缺点，选择的标准常常要依靠过去经验和实践比较。选择的原则是该方法不影响目的蛋白或产物的结构和功能，或者说，采用的方法可以避免造成目的蛋白或产物的变性或失活。常见组织和细胞的破碎和溶解一般都采用传统的标准方法，有时为了增加活性蛋白的回收率或针对产物蛋白的特性尝试或筛选细胞破碎和溶解的方法也很有必要。细胞破碎前，组织一般用缓冲液洗去残留血液和污染物；培养细胞通常用缓冲液混悬后离心，除去残留培养液

4、等。细胞破碎获得的抽提物称为匀浆。匀浆根据不同需要可以在12000g×10min到100000g×1h范围内离心。沉淀主要含有膜组分等，应弃去。上清含有目的蛋白称为粗提物。如果粗提物有漂浮颗粒，可用纱布或玻璃纤维滤去后再进一步纯化。匀浆法匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。它的工作原理是通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。市售的匀浆器主要有四类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器和用于规模生产的高压匀浆器。玻璃匀浆器的匀浆杵有玻璃制的，也有特夫隆制的，既可以手动也可以电动。由于匀浆过

5、程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷或在冷室内匀浆。匀浆时所需匀浆缓冲液的体积在不同条件下可有很大差别，有时甚至可为湿重组织体积的9-10倍。该匀浆器由一根一端表面磨砂的玻璃杵和一个内壁磨砂的玻璃管组成。使用时，先用锋利的刀片把组织切成碎块，然后把组织碎块或细胞悬液加入套管后，手工或以电动搅拌机旋转研磨，玻璃杆在套管中上下移动时产生机械切力使细胞破碎。这种方法对生物大分子破坏少

6、，是目前广泛使用的一种细胞破碎方法。(1)杵状玻璃匀浆器法匀浆器由调速器、支架、马达、带杆叶片刀和梅花玻璃杯组成。使用时先将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入玻璃杯中，至杯体积的1/3即可，盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓缓调节旋转速度。一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。组织捣碎机高速转动时易产热可导致分离物的降解，因此注意不能持续时间过久，必要时使用循环冷却水降温。(2)高速组织匀浆器法超声波法输入高能超声波可以破碎细胞，其机理可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化

7、现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性。过低的强度将降低破碎效率。最好在正式实验前用多余的样品进行试验。超声破碎在处理少量样品时操作简便，液量损失少，此法多适用于微生物材料和脑组织匀浆。此法的缺点是超声波产生的化学自由基能使敏感的活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，大容量装置声能传递、散热均有困难，在处理过程中会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声

8、波敏感的酶和核酸应慎用。高压匀浆法细胞悬液从高压室的环状隙高速喷射到静止的撞击环上，被迫改变方向经出口管流出。此过程中细胞经历了高速造成的剪切、碰撞及高压到常压的变化，从而破碎释放内含物。增加压力或增加破碎次数都能提高破碎效率，但压力增加到一定程度零部件磨损较大。为防止污染，使用前后高压室至出口管需彻底清洁。该法常用来裂解细菌和酵母。适用于中等体积(10-30ml)的样品