肿瘤生物治疗实验室常用实验方法-终稿

《肿瘤生物治疗实验室常用实验方法-终稿》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、肿瘤生物治疗实验室常用实验方法总RNA的提取(Trizol法提取)在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于・80°C冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1.提取组织RNA时，每50〜lOOmg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10X106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温(15°C~3

2、0°C)下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15°C~30°C)放置2~3分钟后，12000g(2°C-8°C)离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15°C~30°C)放置10分钟，12000g(2°C〜8°C)离心10分钟；5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2°C~8°C)离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-

3、freewater溶解RNA沉淀。PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRaTaq™,TaKaRaExTaq™和Pyrobest™DNAPolymeraseoTaKaRaTaq™是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaExTaq™是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物丁端附有一个“A"碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest1MDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高

4、，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRaTaq™或TaKaRaExTaq™的配方ReagentQuantity,for50glofreactionmixture10XPCRbuffer(Mg2+free)5p,lMgCl2(25mM)如TaKaRaTaq™加3pl如TaKaRaExTaq™力口4gl2.5mMdNTPmix4pl10(iMPrimer上游lyl10pMPrimer下游1pilTemplateDNA1

5、ilTaq或ExTaqDNAPolymerase0.25

6、ilSterilede

7、ionizedwaterUpto50(ll1Total50

8、il/SamplePyrobest1MDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50glofreactionmixture1OXPyrobestbuffer5

9、xl2.5mMdNTPmix4gl10(iMPrimer上游lyl10pMPrimer下游l

10、ilTemplateDNAlplAPyrobestDNAPolymerase0.25^1SteriledeionizedwaterUpto50(ll1Total50

11、il/Sample①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20〜50卩

12、1以节约试剂；②将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；③如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30〜50卩1的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2.按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。•StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote厂起始变性94〜951-311变性94〜950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C,再根据反应结果优化1退火37-700.5-2厂延伸70-75根据扩增产物的大

13、小每分钟延伸lOOObp1最终延伸70-75101反应结束后，抽取扩增样品5

14、il,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol:TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity,for50ylofreactionmixturelOxOneStepRNAPCRBuffer5pl25mMMgCl2lOpl10mMdNTPmix5

15、ilRNaseInhibitor(40U/g