肿瘤生物治疗实验室常用实验方法

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1、肿瘤生物治疗实验室常用实验方法肿瘤生物治疗实验室常用实验方法1总RNA的提取（Trizol法提取）2PCR3RT-PCR5琼脂糖核酸电泳7胶回收纯化DNA8大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）9乙醇沉淀DNA9酶切10连接10感受态细胞的制备11转化12重组子的筛选和鉴定13真核细胞的转染13转染细胞的稳定筛选14重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量15肿瘤细胞体外传代培养及保种16肿瘤动物模型的建立17小鼠尾静脉注射方法18肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验18人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养18实验动物免疫方案19血清制备20ELISA20血清学筛选克隆新抗原/新基因21ELISPOT25藻酸

2、盐包裹实验25重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作26组织病理技术31免疫组化染色33流式细胞仪常用的几种检测方法35WesternBlot(免疫印迹法)40电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）41PVDF膜上蛋白的可逆染色43人肿瘤抗原的识别与鉴定46蛋白质组实验流程47双向电泳的样品的制备48双向电泳操作步骤49SDS-PAGE胶染色51双向电泳蛋白点的切取和保存5269数据库搜索(Databasessearch)53主要的公共数据库及网址54Mascot54MOWSE54PeptideSearch54ProteinProspector54Prowl54EXPASY中国镜像站点（

3、BIpeptident）54双向电泳常见问题与原因54IEF54SDS-PAGE,staining55蛋白质的序列分析流程56聚丙烯酰胺凝胶的配制58双向电泳常用溶液配方59总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml

4、Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温（15℃～30℃）下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃

5、～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。69PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRaTaqTM，TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTMDNAPolymera

6、se也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPCRbuffer（Mg2+free）5µlMgCl2（25mM）如TaKaRaTaqTM加3µl如TaKaRaEXTaqTM加4µl2.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µlTaq或EXTa

7、qDNAPolymerase0.25µlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/SamplePyrobestTMDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPyrobestbuffer5µl692.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µl