分子生物学实验终稿

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1、重组DNA技术分子生物学实验技术复制翻译转录不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。基因重组是自然界的一种常见现象，是物种演变、生物进化的基础。不同来源的DNA分子重组DNA分子基因重组在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DNA的活细胞,加以纯化、扩增，成为克隆。重组DNA技术克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。如细菌克隆、动物克隆和分子（DNA）克隆等。Restrictionenzymes:选（分）切接转→筛→扩重组DNA技术的基本过程其作用是

2、：携带目的基因DNA（或外源DNA)进入宿主细胞（大肠杆菌，哺乳动物细胞等）。使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。载体的选择常用载体：质粒DNA，噬菌体DNA，病毒DNA1．能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增；2．有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3．载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；4．有一定的筛选标记，易于识别和筛选；5．表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6．生物安全性好。载体的选择标准insertBamHIreplication存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。（1）本实验应用的质粒质粒D

3、NA的提取和鉴定碱裂解法抽提质粒DNA:利用基因组DNA和质粒DNA变性和复性的差异来分离提取质粒。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型。而染色体DNA不易复性而形成缠连的网状结构。进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DNA。将菌液倒入1.5ml离心管中(尽量倒满)12000rpm/30s(沉淀菌体)↓在原管中重复上述操作1次弃上清扣干,加入预冷的

4、solutionⅠ100μL,剧烈振荡打散菌体,冰浴5min↓（以下操作要轻柔）加入新配制的solutionⅡ200μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，室温放置5min↓（此时液体应由混浊变为透明粘稠）加入预冷的solutionⅢ150μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，冰浴5min↓离心12000rpm/5min小心将含有质粒DNA的上清移至另一离心管中↓加等体积氯仿,轻微振荡，离心12000rpm/2min↓转移上清液至另一离心管加入2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置2分钟↓离心12000rpm/5min弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀，离心12000rpm/2min，弃上清↓重复洗涤1

5、次弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干↓室温放置15min干燥加入1×TE30μL溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等。SolutionI中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。SolutionII要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solutionII后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性。加入solutionII后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。质粒DNA提取过程中

6、动作要轻柔，以免对DNA造成损伤。为什么用无水乙醇沉淀DNA？这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNADNA的电泳原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度

7、存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖浓度%线状DNA分子分离范围Kb0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的