放线菌发酵制药-2011年6月23日

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1、学习情境三放线菌发酵制药发酵制药子学习情境3.1四环素发酵任务一发酵准备一、发酵罐的清洗1、发酵罐的结构不锈钢搅拌罐主要有不锈钢壳体、夹套、搅拌装置、通风及空气分布管、挡板、接种孔、多个点击插孔、多个流加孔以及各个相关管道的连接口组成。2、发酵罐的清洗从接种孔加入70L左右的清水，启动搅拌，转速为100r/min左右，用蒸汽加热清水至121℃左右，搅拌30min左右，以此清洗发酵罐。清洗完毕，利用空气压力排出洗水，并用空气吹干发酵罐。二、发酵设备检查检查项目：管路连接阀门密闭性仪表校正三、发酵设备灭菌1、消毒与灭

2、菌在发酵工业中的应用消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢。消灭杂菌和防止杂菌污染。关于灭菌和消毒的不正确的理解是（）A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是相同的C．接种环用灼烧法灭菌D．常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法2、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）；干热灭菌法灼烧灭菌、在

3、电热或红外线在设备内加热主要用于保持干燥的物料、器具等湿热灭菌法借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌彻底3）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易缺点：1)设备费用高2）不能用于怕受潮的物料灭菌射线灭菌紫外线化学药品灭菌法表面消毒剂高锰酸钾溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛37％、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚

4、类3、发酵罐灭菌（空消）灭菌压力：0.147—0.18MPa，45—60min。注意事项：空消后，先用无菌空气保压，灭菌的培养基、相关物料输入罐内后，打开冷却系统进行冷却。4、附属设备的灭菌分空气过滤器：发酵罐灭菌之前灭菌，灭菌后空气吹干备用。补料系统：补料管路：与补料罐同时灭菌，保温时间1小时。消沫剂系统：蒸汽压力0.15MPa，保温30分钟。消沫剂管路：与补料罐同时灭菌，保温时间1小时。移种管路：蒸汽压力0.30—0.45MPa，保温时间1小时。任务二种子制备一、培养基配制1、孢子培养基（g/L）小麦麸皮35琼

5、脂20MgSO40.1KH2PO40.2(NH4)2HPO40.3蒸馏水pH自然2、种子培养基（g/L）黄豆饼粉20淀粉40酵母粉5蛋白胨5MgSO40.25KH2PO40.2(NH4)2SO43CaCO343、发酵培养基（g/L）黄豆饼粉40淀粉100酵母粉2.5蛋白胨15MgSO40.25CaCO34(NH4)2SO43a-淀粉酶（105U/mL）0.1mL二、培养基灭菌1、分批灭菌将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定的时间，再冷却至发酵要求的温度，称为分批发酵或实罐

6、灭菌。典型的分批发酵工艺流程图培养基的预热培养基先加热到80－90℃，然后再导入蒸汽升温到120－180℃。目的：1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。培养基灭菌从各路通入蒸汽（进气口、排料口、取样口），温度升到120－130℃，保温30min分批灭菌的注意事项各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排气量不宜过大，以节约蒸汽。灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，

7、然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。三、孢子制备1、接种无菌条件，接种斜面。接种操作程序见下图。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。（2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。（3）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管口一周。（4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将

8、接种环抽出。（6）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。（5）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线，线要画得细些。2、培养将接种后的试管放入恒温箱内，37℃培养5d。四、种子培养种子扩大培养流程图1、2-保藏种子3-斜面4-摇瓶5-茄子瓶6-固体培养7、8-种子罐9-发酵罐1、任务：获得大量的活力强的种子，以便在发酵罐的发