Tricine-SDS-PAGE Protocol中文版-1

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1、Tricine-sds-page一．简介Tricine-SDS-page通常用来分离大小在 1–100kDa的蛋白，尤其是分子量小于30kDa的蛋白质。在低分子量范围Tricine-SDS-page和传统的Glycine–SDS-PAGE分辨率的直接比较展示（图1）。而且相较于其他电泳，Tricine-SDS-page具有低浓度的聚丙烯酰胺，这对分离疏水性蛋白非常关键。Glycine–SDS-PAGE和Tricine–SDS-PAGE都是利用SDS电泳技术来分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶有两个特征数值，一个是丙烯酰胺和双丙烯酰胺的总百分比浓度（%T），

2、一个是交联剂的百分比浓度（%C）。聚丙烯酰胺凝胶不同浓度可以分离不同大小的蛋白质，比如：10%的凝胶分离范围为1-100kDa（图2a），16%的凝胶分离范围为1-70kDa（图2b），而Tricine-SDS-page可提供更大的分离范围，特别适于小蛋白质和多肽的分离。通过使用16%T，6%C凝胶（图2C）和添加6M尿素进一步提高小分子蛋白的分离能力（图2d）。通常采用考马斯亮蓝染色蛋白条带，条带蛋白含量至少含0.2μg，并且可以通过染色程度来估算蛋白中亚基比例，除了极度疏水的亚基，其染色效果太差。对于疏水性的蛋白质转移到惰性膜或做Wester

3、n印记检测，我们可以采用低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，低浓度的聚丙烯酰胺凝胶有利于Western印记检测。二．试剂尿素，甘油，四甲基乙二胺（TEMED），β-巯基乙醇，过硫酸铵（APS），甲醇，乙酸，乙酸铵，丙烯酰胺（AC），双丙烯酰胺（BIS），十二烷基磺酸钠（SDS）还原性样本缓冲液：BufferA：12%SDS，6%巯基乙醇，30%甘油，0.05%考马斯亮蓝G-250,150mMTris/HCl(pH7.0)BufferA/4:将BufferA稀释四倍BufferC: 不加甘油的BufferA非还原性样本缓冲液：BufferB:12%SDS,30

4、%甘油,0.05%考马斯亮蓝G-250(Serva),150mMTris/HCl(pH7.0)BufferB/4:将BufferB稀释四倍BufferD:不加甘油的BufferB三．仪器垂直电泳槽，电源，PVDF膜四．试剂组分染色液（仅考染或银染）：50% 甲醇，10% 乙酸，100mM醋酸铵固定液：10%乙酸，0.025%考马斯亮蓝G-250显色液：0.03%甲醛，2%Na2CO3电泳液：阳极缓冲液(10×)阴极缓冲液(10×)Gelbuffer(3×)Tris(M)1.01.03.0Tricine(M)—1.0—HCl(M)0.225—1.0

5、SDS(%)—1.00.3pH8.9~8.258.45AB-3母液：试验中通常使用AC-BIS-3 母液（49.5%T和3%C混合），即将48gAC和1.5gBIS溶于100ml水中；而对于分离小分子蛋白或多肽，则使用AB-6：46.5gAC和3gBIS溶于100ml水中。注意：1.试剂需储存在 7–10°C,在4°C易结晶。2.AC和BIS有毒性，实验过程中应当带手套。五．实验步骤1.凝胶（时间约2h）：根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照附表配制分离胶：4%浓缩胶10%分离胶16%分离胶16%/6M尿素AB-3(ml)161010G

6、elbuffer(3x)(ml)3101010甘油(g)—33—尿素(g)———10.8加水至终体积(ml)12303030聚合:APS(10%)(μl)90150100100TEMED(μl)9151010(注意：APS和TEMED需最后添加)。2.分离胶凝固后，在其上加入4%浓缩胶（如上表，除了分离<5 kDa蛋白），若分离<5 kDa蛋白，则使用AB-6代替AB-3。3.蛋白制样(30-60min):调整适量蛋白浓度以便蛋白可以加载在胶上，考马斯染色大约0.2-1ug的蛋白条带，理想的蛋白浓度为0.1mg/ml，将蛋白样品与样品缓冲液混合，

7、根据样品浓度加缓冲液，低浓度还原性或非还原性样品取5μl，再加bufferA或B至15μl，高浓度样品取5u，加bufferC或D至15μl，对于颗粒状蛋白样品，悬浮样品到15–20μl bufferA/4或B/4。制样后，样品37°C加热15min，颗粒状样品则加热60min（不要将样品煮沸）。4.安装凝胶到电泳槽上，并添加阳极和阴极电泳液。5.上样：在0.7x5mm上样孔里，添加10μl样品。6.电泳条件：如下表所示，设置适合自己的跑胶电压，开始以30V电压跑胶，当蛋白样品跑分离胶后可将电压调90V，胶会因为电压原因温度升高，但必须控制在35

8、–40°C，快结束时候，可以适当提高电压来缩短电泳时间，一般常规时间跑的胶比过夜跑胶的结果好，尤其是使用10%分离胶。10%(0.7mm