基因工程引物设计-lhyppt课件

《基因工程引物设计-lhyppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、引物设计之浅谈PCR过程内容引物设计的原则Primerpremier5.0的使用植物表达载体引物设计原核表达载体引物设计酵母表达载体引物设计一、引物设计的原则引物长度一般为15-30个核苷酸.在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。碱基分布的均衡性引物Tm值一般要求：55℃-65℃。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2

2、(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物二级结构引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。3’端的末位碱

3、基会导致不同的错配机率．引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。总结1、长度为15-30bp2、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３‘端3、Tm值：55-65℃4、避免二级结构5、3‘端末位为T>G（C）>A二、引物设计软件PrimerPremier5.0生物软件网购买下载，安装后，用文本编辑器打开WIN.

4、INI，将vspace=DU改为vspace=PU，并将其改成只读，便可以使用全部功能。三、植物表达载体构建引物设计设计引物步骤1、对基因进行酶切位点分析2、选择适当的表达载体及酶切位点3、根据上、下游序列设计引物举例>lipidtransferproteinATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGG

5、TTCCCCACCACCTGCTTGTTGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATGGCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGAEnzymesthatdonotcut:ApaLI,ApoI,AscI,AseI,AsiSI,AvaI,AvaII,AvrII,BamHI,B

6、anII,BbeI,BbsI,BbvCI,BceAI,BcgI,BcgI,BciVI,BclI,BfrBI,BglI,BglII,BlpI,Bme1580I,BmrI,BmtI,BplI,BpmI,Bpu10I,BpuEI,BsaI,BsaAI,BsaBI,BsaHI,BsaWI,BsaXI,BseRI,BseYI,BsgI,BsiHKAI,BsiWI,BsmI,BsmFI,Bsp1286I,BspEI,EcoICRI,Eco57MI,EcoNI,EcoO109I,EcoRI,EcoRV,FalI,FokI,FseI,FspI,FspAI,Hae

7、II,HaeIII,HgaI,Hin4I,Hin4I,HincII,HindIII,HinfI,HpaI,HpaII,HphI,Hpy188I,HpyCH4IV,KasI,MaeIII,MfeI,MluI,MlyI,MmeI,MscI,MseI,MslI,NaeI,NarI,NciI,NcoI,NdeI,NgoMIV,NheI,NotI,NruI,NsiI,PacI,PciI,PleI,PmeI,PmlI,PpiI,PpiI,PpuMI,PshAI,PsiI,PspGI,PspOMI,PsrI,PsrI,PstIPvuII,RsrII,SacI,

8、SacII,SalI,SanDI,Sau96I,SbfI,ScaI,ScrFI,SexAI,SfcI,SfiI,SfoI,SgrAI,S