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时间:2020-07-25
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1、引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度(primerlength)产物长度(productlength)序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量(composition)引物二聚体及发夹结构(duplexformationandhairpin)阅读框1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度2.产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对.3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含
2、量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)4.引物的GC含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物自身引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcg
3、ggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagc
4、ccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaact
5、ggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaaNR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGC
6、GAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATC
7、GACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCA
8、CTCTC
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