汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组（医学论文）

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1、汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组作者：康文臻，黄长形，白雪帆，杨为松，谢玉梅，郝春秋，张岩【关键词】汉坦病毒关键词:汉坦病毒;肾综合征出血热;空斑实验;基因重组;聚合酶链式反应摘要:目的探明汉坦病毒汉滩型与希望山型之间能否发生基因重排，以及发生重排的频率和特点•方法用汉坦病毒汉滩型76-118株与希望山型PHV株混合感染VeroE6细胞，空斑形成实验挑取子代病毒克隆株，传代培养后用RT-PCR方法鉴定子代病毒基因型•结果子代病毒14/36来源于PHV株;12/36来源于76-118株;5/36汉滩型与希望山型分型引物扩增均为阳性;1株子代病毒L,S片断均来源于76-118株，而M片段

2、两种引物扩增均为阳性;2株子代病毒L片断来源于76-118株，S片断来源于PHV株，M片段两种引物扩增均为阳性・1株子代病毒L,S片断均来源于76-118株，而M片段来源于PHV株•结论汉坦病毒汉滩型与希望山型之间可以发生基因片段的重排.Keywords:hantavirusrecombinationgenetic;polymerasechainreactionAbstract:AIMTodeterminethefrequencyandcharacteris-ticsofgenesegmentsreassortmentbetweenHantaanvirusandProspectHill

3、virus.METHODSMixedinfectionswereinitiatedintissueculturebyusingHantaanvirusstrains(76-118)andProspectHillVirusStrains(PHV).Potentialreas-sortantvirusplaqueswerescreenedbymultiplexRT-PCR,usingprimersspecificforindividualgenomesegmentsofeachstrain.RESULTSMostoftheprogenyvirusplaques(28of36)hadthep

4、arentalgenotypeof76-118strainorPHVstrain.5of36plaqueshadmixedgenotypesthatyieldedRT-PCRbandsforthesamesegmentofbothparentalstrains.Reassortantvirusesweredetectedin4of36progenyplaquestested.Inaddition,approximately8.33%oftheprogenyvirusplaquesappearedtocontainMsegmentsoriginatingfrombothparentalv

5、irusstrains,i.e.,theywerediploid.CONCLUSIONGenctici'eassortmentcanoccurbetweenHantaanvirusstrainsandProspectHillvirusstrains・0引言人们发现当将两个不同的布尼亚病毒株同时感染同一宿主或细胞时，它们之间的基因片段可以重新组合，即发生基因重排•近年来汉坦病毒的基因重排国外已有报道[1,2]・我们探明汉坦病毒汉滩型（I型，Hantaanvirus）和希望山型（IV型，ProspectHillvirus）之间基因片段能否重组如下.1材料和方法1.1材料汉坦病毒76-118

6、株，PHV株，Viro-E6细胞均由中国药品生物制品药品检定所提供.<1.2方法将汉坦病毒76-118株和PHV株等量同时接种至Viro-E6细胞，在感染病毒6d后每日刮片检测病毒抗原（免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人IgG）,当荧光达到〜时，将细胞及上清冻融3次，离心取上清备用•在4C条件下，将76-118和PHV混种的毒种做10倍系列稀释，选取10-4,10-5,10-63个稀释度接种于6孔板的VeroE6细胞单层上（0.4mL/?L）进行空斑形成实验[7],每个稀释度两孔，37£吸附lh,加第1层琼脂培养基，6d后加第2层琼脂培养基（含中性红1300）,24~48h

7、观察空斑形成情况并用毛吸管挑取空斑36个•将挑取的空斑分别加入VeroE6细胞中培养，至培养乙10d分别刮片检测病毒抗原（免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人IgG）.10d后将培养的毒株分别收获，冻融后分别再次接种至veroE6细胞，至培养6d后每日刮片检测病毒抗原(免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人IgG),8d收获，冻融后加200mLL-l小牛血清-70°C冻存・700jLiLTrizol(Gico公司产品)加300