【精品】生物分析原理

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1、聚合酶链反应简称PCR技术PCR特点：操作简单；扩增速度快，可在数小时内使DNA或RNA片段放大百万倍。基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR循环-第一步-加热变性PCR循环.第二步-引物与靶序列退火PCR循环-第三步・引物延伸第1个PCR循环完成后-得到两个拷贝的靶序列典型PCR反应体系：1•复制模板2•耐热DNA聚合酶3•引物4•缓冲体系5•底物DNA的合成，无论是在体内，还是在体外，都是在DNA聚合酶的作用下，在模板的指导下合成的。在PCR反应中的模板，指的是待扩增的DNA片

2、段。选择合适的引物是PCR成功的关键。引物设计的基本要求（原则）：（1）引物长度一般为15~30个核昔酸。（2）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现瞟吟、囉喘碱基堆积现象。（3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3,端的互补重叠。（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3,末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。(6)引物3,端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3,端最佳

3、碱基选择是G和C。(7)引物浓度，引物的浓度一般为0・1〜0・5umol/L,引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增oPCR实验中应注意的事项:(1)隔离不同操作区，包括样品制备区；PCR操作区；反应产物分析区等；(2)对于所用试剂必须分装，以减少重复取样所致的污染;(3)采用一次性吸头和加样器进行PCR取样和加样操作，样品制备应严格按无菌操作原则进行。为防止PCR过程中出现假阳性，应设置以下几个对照:(1)阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR反应;(2)阴性对照：阴性DNA模板参与的PCR反应;(3

4、)试剂对照：不含任何DNA模板，但具有所有反应试剂的PCR反应。PCR循环次数与产物的积累:从变性、退火到延伸一次称为一个循环，每循环一次产物增加一倍，即以指数增长。但PCR反应是在酶的作用下完成的，随着产物的增加，引物和底物的消耗，使酶促反应越来越慢，达到所谓的平台期。筑巢PCR特点：筑巢PCR扩增时，对目的DNA的特异性高且适合于极少量模板的扩增。•吸附薄层层析特点：1•分离效果好2•样品用量少3•灵敏度高4•分析速度快5•设备简单便于操作按照层析中固定相的性质•吸附薄层层析2•分配薄层层析3•离子

5、交换薄层层析4•高效薄层层析对背材的要求：(1)有一定的机械强度(2)能耐受展开剂和显色剂的化学作用和腐蚀(3)在薄层上进行反应时，能耐受反应的温度(4)表面光滑平整(5)厚度均匀并有一定规格(6)价格低廉常用的背材有玻璃、铝箔.塑料，最好的是玻璃背材。用玻璃为背材的薄层叫薄层板.用铝箔的叫薄层.用塑料的叫薄层片。吸附剂的选择：吸附剂的选择是应用吸附层析过程中的关能做为吸附剂物质的基本性质(1)表面积大，内部多孔的颗粒或纤维状固体物质；(2)在展开剂中不溶，对展开剂和样品组分不起破坏或分解作用；(3)在

6、溶液中能吸附样品组分，吸附后又容易用展开剂把样品组分从它的表面解吸下来，吸附剂应具有可逆的吸附作用；(4)最好是白色的固体，以便于观察层析结果。选择吸附剂的原则：首先决定于样品组分的性质，其次要考虑薄层的显色方法和吸附剂是否容易得到。理想的吸附剂应具有以下的条件：(1)纯度高；(2)结构均匀，有一定的比表面积；(3)具有一定的机械强度和稳定性；(4)有适当的吸附能力，可逆性大。吸附剂的活化：在一定温度下烘烤除去水而提高对物质吸附能力的方法称。•对铺层的要求:•K铺成的薄层必须在板的各个部位厚度一致(表面

7、平整，无划痕，无气泡)。只有薄层的厚度一致，在定量扫描时的结果才能准确;•2＞吸附剂与背材的粘附性强，在层析及层析后的显色过程中不脱落。-对展开剂的基本要求•1、溶剂应能使待测组分很好地溶解•2、使待测各组分之间均能达到基线分离•3>展开后的组分斑点圆而集中没有拖尾现象•4、待测组分的Rf最好在0.25-0.5o如样品中待测组分较多时,Rf也可在0.25-0.75o・5、与组分和吸附剂不存在化学反应•6.具有适中的沸点和粘度•展开剂必须新鲜配制且只能使用一次，原因如下：1、低沸点的溶剂容易挥发2、极性大

8、的溶剂优先被吸附剂吸附，在展开的过程中展开剂的组分发生了变化3、在第一次展开时，吸附剂中的杂质可能被带入，造成污染・溶剂分子与样品组分分子之间的作用1、色散作用：非极性分子之间存在的作用力叫色散力。2、偶极作用：极性分子具有永久偶极矩，能产生偶极诱导和偶极定向。3、氢键作用：是质子供体分子和质子受体分子间的作用力。4、介电作用：组分离子和高介电常数的溶剂之间的作用。电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象•迁移率（或泳动