胶体化学57079

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1、双向凝胶电泳缓冲剂对小麦蛋白的有效溶解性一.简介二.常见缓冲液、缓冲试剂三.电泳方法四.总结一.简介植物组织是由多种具有不同性能的蛋白质组成的。不同种类的蛋白质经提取增溶后用双向凝胶电泳方法进行有效的蛋白分析是一个有挑战性的过程。可溶酸性蛋白的最适PH值是4-7.缓冲剂由尿素，硫脲和PH值固定的梯度缓冲剂组成。碱性蛋白的最适PH值为6-11。这两种缓冲剂产生的双向凝胶具有高分辨率，高品质和最大量的检测蛋白斑点。二.2D凝胶电泳缓冲液和试剂样本制备是2D凝胶电泳的关键步骤，且是实验成功的关键。在样

2、本制备程序设计过程中，多个因素都发挥了重要的作用。缓冲剂包括：样品重泡胀缓冲试剂两性电解质载体IPG胶条电泳缓冲液和聚焦缓冲液2D凝胶电泳样品重泡胀缓冲液2D凝胶电泳样品重泡胀缓冲液又称为样品缓冲液，可用于蛋白样本的变性和溶解及IPG胶条的重泡胀。样本制备的第一步是选择或制备合适的样品重泡胀缓冲液。由于蛋白质的种类繁多，因此没有一种通用的样品重泡胀缓冲液。选择缓冲液时需要考虑的两个因素是起始材料和实验目的。样品重泡胀缓冲液必须：在IPG胶条重泡胀和IEF过程中保持蛋白质的溶液状态不影响蛋白质的p

3、I缓冲液一般含有变性剂(尿素或尿素/硫脲)、增溶剂(非离子或两性离子去污剂和两性电解质)及还原剂(DTT)。下页列出了样品重泡胀缓冲液的主要成分、功能及推荐浓度。请注意必须根据蛋白质的溶解度优化终浓度。通常通过改变去污剂、尿素、两性电解质和还原剂的浓度完成优化。使用载体两性电解质与IPG胶条载体两性电解质使用载体两性电解质在试管凝胶(在长玻璃管中制备的聚丙烯酰胺凝胶)中进行IEF。将蛋白质样本上样至凝胶中，在高电压下进行IEF。通以电流后，载体两性电解质即可形成连续的pH梯度。形成梯度后，蛋白质

4、向其pI迁移。IEF结束时，从试管中取出凝胶，在含有SDS的缓冲液中进行平衡，制备在二维SDS凝胶中迁移的蛋白质。将试管凝胶置于含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶的顶端，进行SDS-PAGE电泳。载体两性电解质的缺点使用载体两性电解质进行IEF的主要缺点：pH梯度易向阴极漂移由于两性电解质存在批次间差异，因此IEF分离的重复性较差由于载体两性电解质可与蛋白质结合，因此会改变蛋白质的移动性试管凝胶的低机械强度导致凝胶破碎IPG胶条将固相pH梯度(IPG)凝胶用于第一维IEF，可避免载体两性电解质带来的问题

5、。使用丙烯酰胺基缓冲液(丙烯酰胺可衍生带电荷的基团)在塑料衬垫上制备聚丙烯酰胺凝胶，制成固相pH梯度(IPG)凝胶。由于在制胶时已经形成pH梯度，因此其梯度更稳定，可重复性更好。聚合形成IPG凝胶后，对其进行冲洗、干燥并切成窄条状(IPG胶条)。IPG胶条的pH梯度可以是线性的或非线性的(NL)。非线性梯度通常在pH4-7之间，形成反曲型pH梯度。非线性IPG胶条可用于含有pI范围在4-7之间的多种蛋白质的样本分析，这些样本通常是所有种属的裂解粗产物。IPG胶条的优点下面列出了使用IPG胶条作为

6、第一维IEF的优点：更稳定且重复性更好的pH梯度减少了阴极漂移由于IPG胶条是在塑料衬垫上制备的，因此其机械强度较高，从而最大程度地减少了凝胶破碎上样方法导致蛋白质上样量提高三.影响蛋白质的泳动速度的因素：内不因素——主要决定于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。外界因素——如溶液的pH值、离子强度、电场强度、温度等也会影响蛋白颗粒的泳动速度。不同蛋白质的等电点分子大小和形状不同，在同一pH时带电荷数不等，因而其在同一电泳条件下的泳动速度不同因而可被分开。双向凝胶电泳先将混合物在一个直径1mm的

7、玻璃管凝胶中进行等电聚焦凝胶。聚焦后将凝胶条小心的从毛细管中取出，然后放到另一平板凝胶的顶部（垂直板）或一端（水平板），再让胶条中已经分离的组分在平板胶中走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于蛋白质的等电点和分子质量之间没有什么必然的联系，因此，经过双向电泳可将数千种蛋白质分开，显示出极高的分辨力。等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成的两性电解质载体，在电场的作用下会自发形成一个连续的pH梯度。蛋白质样品在电泳中被分离，运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点

8、不同，因而在等电聚焦电泳中得到有效分离。在等电聚焦电泳中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛作用。它的分辨力高，可分离等电点相差0.01~0.02pH单位的蛋白质，可用来准确测定蛋白质的等电点，精确度可达0.01pH单位。四.小结：蛋白质的分离纯化蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力。蛋白质的酸碱性质：蛋白质是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，此外还有