微生物实验操作规范

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1、细菌实验操作部分㈠培养基的配置操作步骤1.称量：按培养基配方比例依次准确称量放入烧杯中（用称量勺，称量纸和电子天平）。2.在烧杯中先加入少量所需蒸馏水，用玻璃棒搅匀，然后再石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底。3.调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测，反之用1mol/LHCL。4.分装：（1

2、）液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。5.加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞或硅胶塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6.包扎：加赛后，将全部试管用皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸（报纸即可），以防止灭菌时冷凝水润湿。用记号笔注明日期名称。7.灭菌：将上述培养基放入121摄氏度，20分钟高压

3、蒸汽灭菌。8.搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管塞端搁在玻璃帮上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。9.无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24至48小时，以检查灭菌是否彻底。几种常用培养基成分1．LBMedium(LB培养基)Yeastextact(酵母膏)5gPeptone(蛋白胨)10gNaCl10gAgar(琼脂)1-2%Distilledwater(蒸馏水)1000mlpH7.0适用范围：大肠埃希氏菌（大肠杆菌）2.TryptonSoyAgar胰蛋白胨17.0g大豆胨3.0g

4、葡萄糖2.5g琼脂20.0gNaCl5.0gK2HPO42.5g蒸馏水1000ml3.NutrientAgar(营养肉汁琼脂)Pepton(蛋白胨)5gBeefextract(牛肉膏)30gNaCl5gAgar(琼脂)15gDistilledwater(蒸馏水)Adjust(调)pHto7.0-7.24.RSL-盐酸鸟氨酸6.5g氯化钠5.0gL-盐酸赖氨酸5.0g脱氧胆酸钠1.0gL-盐酸半胱氨酸0.3g酵母提取物3.0g麦芽糖3.5g溴麝香草酚蓝0.03g硫代硫酸钠6.8g新生毒素0.005g枸橼酸铁铵0.8g琼脂1

5、2.5g蒸馏水1000mL5.麦康凯蛋白胨20.0g乳糖10.0g牛胆盐5.0g氯化钠5.0g中性红0.03g琼脂14.0gpH6.9-7.3㈡几种试剂的制备波恩试剂：75%饱和苦味酸25%福尔马林5%冰乙酸㈢细菌的分离1．待检材料的处理无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。（1）加热处理法当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75℃水浴30min(或80℃15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接

6、种到适当的培养基上。（2）接种易感动物把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。（3）化学药品处理有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。因此可将适宜的化学药品加入培养基中。如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；2．平板划线分离培养法（1）培养基平板的准备取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其

7、分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。（2）各种物品的准备取出待检病料，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。（3）平板划线以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，

8、一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。（4）培养物的观察病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检