基因型鉴定 中科院版

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1、1.鼠尾DNA提取第一天:1.剪取小鼠尾尖(同样适用于脚趾,胚胎组织,卵黄膜等,若不立即提取,可以放置4℃数日)放入1.5mlEP管。2.每管加入鼠尾裂解液350ul+10ul蛋白酶K(简称PK,10mg/ml,现用现加)。3.55℃水浴消化过夜第二天:4.用劲将消化好的组织摇匀(可用振荡器摇匀)。5.每管加入350ul酚/氯仿(苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1,事先配好,4℃保存)。6.上下充分混匀,室温静置3分钟后,离心,12000转,30分钟。7.取出离心后的EP管,可见液体分为三层,取上层无色水相液体约200μl于新1.5mlE

2、P管中,注意勿吸取中层液体。(不能将中间的蛋白层吸起来,否则会对后续的实验造成影响。为防止压力过大,可使用切去尖端的枪头)。8.向新EP管中加入400μl无水乙醇(为2倍于上清的体积),上下颠倒混匀,此时应可看到白色丝状样的DNA。9.离心12000转,10分钟。10.可看到有白色沉淀,弃去上清,加入1ml的75%乙醇,将沉淀弹起,以便去除DNA上过多的离子。11.离心,12000转,10分钟。12.弃去上清,倒置EP管于吸水纸上,室温干燥约15分钟(注意不能过分干燥,以免基因组DNA难溶解)。13.加入150-200μl(根据DNA沉

3、淀的量)无菌蒸馏水或者是TEBuffer,可放置37℃助溶。14.短期4℃,长期-20℃保存。相关配方:1.鼠尾裂解液配方1000ml溶解液中含:100mMTris-HClpH8.55mMEDTA0.2%SDS200mMNaCl室温保存。2.蛋白酶K溶液:取100mg蛋白酶K,加去离子水10ml使成10mg/ml,分装后冻存于-20℃,用时溶解。3.酚/氯仿:取Tris平衡酚50ml,氯仿48ml,异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀,4℃避光保存。1.基因鉴定PCR反应标准的PCR反应体系:     10×扩增缓冲液 10ul 

4、4种dNTP混合物 各200umol/L  引物     各10~100pmol    模板DNA    0.1~2ug    TaqDNA聚合酶 2.5U    Mg2+      1.5mmol/L   加双或三蒸水至 100ul以我们实验室常用的PCR25ul体系为例:10xbuffer:2.5uldNTP2ulMgCl2:1.5ulPrimerF:1ulPrimerR:1ulTaq酶:0.5ulDNA模板:1~3ul去离子水加至:25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR操作注意事项:1)PCR的复合管配制需在冰上进行,尤其t

5、aq酶需始终放于冰上,或者在最后加入时从-20°冰箱拿出,加完后立即放回。2)PCR反应极为灵敏,操作过程应当注意避免样本之间的相互污染,吸取不同样本时应当换枪头。1.琼脂糖凝胶电泳1.根据欲分离DNA片断大小用凝胶缓冲液(TAE缓冲液)配制适宜浓度的琼脂糖凝胶,以1%胶为例:称取琼脂糖1克,倒入通风橱内的锥形瓶中,尽量不要让粉末沾在内壁上。用量筒量取1×TAE100ml,倒入锥形瓶,戴入一次性手套混匀。2.戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉,加热3min左右,使琼脂糖彻底溶解,看不到颗粒为止。在此期间插好制胶的板槽和梳子。3.迅速将锥形瓶

6、置于通风橱内,冷却片刻,用通风橱内20μl枪,吸6~10ul(0.05%)的EB,插入液面,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,注意避免产生气泡,如有气泡,应设法除去。(枪头应丢入指定垃圾箱)4.等待30min冷却。5.凝固后,戴一次性手套,先两端起开一点梳子,再将梳子完全拔出,将胶安放在电泳槽内。6.向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去。退掉一次性手套加样。7.每个25ul样本加入6×buffer5ul,混匀后,将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内。8.加样后。带上一次性手套接通电

7、源,插上+/-极,切记DNA样品由负极往正极泳动。设置电压,一般为60-100V,按下RUN开始电泳,电泳15-30分钟即可。9.根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;一般前端染料到2/3处即可。10.电泳完毕后,戴一次性手套关掉电泳仪。拿出胶版,推出胶。在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

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