Sp1（530-623）锌指蛋白（三个锌指结构域）的表

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1、Spl（530-623）锌指蛋白（三个ZFP结构域）的表达与纯化撰写人：陈思明2013-04-19修订人：准备：1.质粒:SGl-Spl（530-623）2.金属（Ni柱）螯合树脂（每升表达液需要3ml树脂）3.相关缓冲液ResuspendBuffer20mMTris,pH=7.4,500mMNaCl,8MureaWashBufferResuspendBuffer+20mMimmidazole;ElutionBufferResuspendBufl^r+500mMimmidazole;表达条件:质粒抗性氨节50

2、ig/ml表达菌珠BL21(

3、DE3)诱导温度、OD6oo37°C;OD60o=0.8至1IPTG浓度、诱导时间优化后采用0.8mM;诱导4hours纯化步骤：（以1L菌液为例）（详见陈思明实验记录2009年11月22日，第一本实验记录本）1.收菌：4000rpmx20min2.破碎菌液：超声或压力（30%功率8min超声即可）【注：1L的菌液收集的菌体重悬于20ml的ResuspendBuffer,超声后包涵体维持在ResuspendBuffer中lh左右，以保证目的蛋白完全溶解】3.离心：16000rpmx30min;留上清，过0.45uM滤膜；【注：由于包涵体处

4、理直接过0.45uM较难通过，浪费滤膜，可以依次用1.20.8pm,0.45

5、im的滤膜，效果较好！】4.结合树酯（预先用ResuspendBuffer平衡）：【注：如果树酯是刚从20%乙醇中取出，用超纯出0洗3・5次，随后平衡10min]将上清（大约20ml左右）与3ml预平衡的树酯混合，放置4°C旋转混合仪上，结合时间30min,随后放掉上清；5.洗涤杂蛋白：加入20mlWashBuffer于Ni柱，并使其慢慢滴下，洗涤时间15min:【注：保证洗涤时间不要低于15min，洗涤过程要保证Ni柱始终处于Buffer条件，不要让Ni柱处于

6、干燥状态】6.洗脫目标蛋白：加入15mlElutionBuffer,放置4°C旋转混合仪上30min,收集洗脱液，并再次用10mlElutionBuffer洗脱Ni柱上残留的目的蛋白。7.树酯再生：（1）先用水清洗2次，除去Ni柱上的尿素；（2）用20mMMES（pH5.0）在旋转混合仪上处理20min,随后用水清洗3・5次；（3）如果树酯长期不用，用20%乙醇保存Ni柱：蛋白复性(参考蛋白变复性方案)1.透析外液的组成为200mMNaCl,5mM柠檬酸钠(防止Zi?+沉淀),10yMZnCl2,5mMp-ME,20mMTris,pH7.

7、42.透析过程中尿素的浓度采用：(a)第一步：外液中含有4M尿素，4度搅拌透析12小时(一般过夜)；(b)第二步：外液中含有3M尿素，4度搅拌透析4小时，(c)第三步：外液中含有2M尿素，4度搅拌透析4小时；(d)第四步：外液中含有1M尿素，4度搅拌透析4小时(e)第五步：外液中不含尿素，4度搅拌透析12小时；(f)第六步：重复第五步透析一次。TEV酶切1.酶切实验中，一般用TEV/Sp1(530-623)体积比为1:10来完成酶切过程。2.1LLB培养基可以获得25mlTEV蛋白酶再加上等体积甘油，混匀后，分管分装，・80度冻存备用；3

8、.酶切电泳鉴定结果见图1116KDa66.245352518.414.4--TEVproteasep1(530-623)Fusionprotein--Sp1(530-623)图1:SDS-PAGE鉴定TEV酶酶切Spl(530-623)蛋口的N端His标签分子筛纯化将Sp1(530-623)前体蛋白的酶切体系，经过超滤杯适当浓缩后，再用分子筛纯化，其分子筛纯化的色谱结果参见图2。在80ml出水体积处有一明显的紫外吸收峰，其表观分子量与Spl(530-623)蛋白分子量基本上吻合；180nSp1(530-623)50_J~

9、osqv209060300-20406080100120140Elutionvolumn/ml图2：分子筛纯化Sp1(530-623)蛋白色谱图Apo蛋白制备a)三个锌指Apo态制备：往Spl(530-623)蛋白样品中加入EDTA(25mM左右)和DTT(50mM左右)，37度反应2小时，脱盐柱处理即可。b)单个锌指、三个锌指的Apo态蛋白都很稳定，浓度可以配到mM级；蛋白保存1.对于三个锌指Spl的保存与使用：a)把分子筛纯化后Spl(530-623)蛋白通过脱盐过程换成如下buffer(50mMHEPES,100mMNaNO3pH6

10、.8)。b)完成buffe】更换，UV定其浓度后，分管分装，500^1/管，・80度冻存备用c)每次使用时候，取出来1支在4度条件下解冻；2.稳定性问题a)Spl蛋白比较稳定，・80冻存可以保