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《Sp1(530-623)锌指蛋白(三个锌指结构域)的表》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、Spl(530-623)锌指蛋白(三个ZFP结构域)的表达与纯化撰写人:陈思明2013-04-19修订人:准备:1.质粒:SGl-Spl(530-623)2.金属(Ni柱)螯合树脂(每升表达液需要3ml树脂)3.相关缓冲液ResuspendBuffer20mMTris,pH=7.4,500mMNaCl,8MureaWashBufferResuspendBuffer+20mMimmidazole;ElutionBufferResuspendBufl^r+500mMimmidazole;表达条件:质粒抗性氨节50
2、ig/ml表达菌珠BL21(
3、DE3)诱导温度、OD6oo37°C;OD60o=0.8至1IPTG浓度、诱导时间优化后采用0.8mM;诱导4hours纯化步骤:(以1L菌液为例)(详见陈思明实验记录2009年11月22日,第一本实验记录本)1.收菌:4000rpmx20min2.破碎菌液:超声或压力(30%功率8min超声即可)【注:1L的菌液收集的菌体重悬于20ml的ResuspendBuffer,超声后包涵体维持在ResuspendBuffer中lh左右,以保证目的蛋白完全溶解】3.离心:16000rpmx30min;留上清,过0.45uM滤膜;【注:由于包涵体处
4、理直接过0.45uM较难通过,浪费滤膜,可以依次用1.20.8pm,0.45
5、im的滤膜,效果较好!】4.结合树酯(预先用ResuspendBuffer平衡):【注:如果树酯是刚从20%乙醇中取出,用超纯出0洗3・5次,随后平衡10min]将上清(大约20ml左右)与3ml预平衡的树酯混合,放置4°C旋转混合仪上,结合时间30min,随后放掉上清;5.洗涤杂蛋白:加入20mlWashBuffer于Ni柱,并使其慢慢滴下,洗涤时间15min:【注:保证洗涤时间不要低于15min,洗涤过程要保证Ni柱始终处于Buffer条件,不要让Ni柱处于
6、干燥状态】6.洗脫目标蛋白:加入15mlElutionBuffer,放置4°C旋转混合仪上30min,收集洗脱液,并再次用10mlElutionBuffer洗脱Ni柱上残留的目的蛋白。7.树酯再生:(1)先用水清洗2次,除去Ni柱上的尿素;(2)用20mMMES(pH5.0)在旋转混合仪上处理20min,随后用水清洗3・5次;(3)如果树酯长期不用,用20%乙醇保存Ni柱:蛋白复性(参考蛋白变复性方案)1.透析外液的组成为200mMNaCl,5mM柠檬酸钠(防止Zi?+沉淀),10yMZnCl2,5mMp-ME,20mMTris,pH7.
7、42.透析过程中尿素的浓度采用:(a)第一步:外液中含有4M尿素,4度搅拌透析12小时(一般过夜);(b)第二步:外液中含有3M尿素,4度搅拌透析4小时,(c)第三步:外液中含有2M尿素,4度搅拌透析4小时;(d)第四步:外液中含有1M尿素,4度搅拌透析4小时(e)第五步:外液中不含尿素,4度搅拌透析12小时;(f)第六步:重复第五步透析一次。TEV酶切1.酶切实验中,一般用TEV/Sp1(530-623)体积比为1:10来完成酶切过程。2.1LLB培养基可以获得25mlTEV蛋白酶再加上等体积甘油,混匀后,分管分装,・80度冻存备用;3
8、.酶切电泳鉴定结果见图1116KDa66.245352518.414.4--TEVproteasep1(530-623)Fusionprotein--Sp1(530-623)图1:SDS-PAGE鉴定TEV酶酶切Spl(530-623)蛋口的N端His标签分子筛纯化将Sp1(530-623)前体蛋白的酶切体系,经过超滤杯适当浓缩后,再用分子筛纯化,其分子筛纯化的色谱结果参见图2。在80ml出水体积处有一明显的紫外吸收峰,其表观分子量与Spl(530-623)蛋白分子量基本上吻合;180nSp1(530-623)50_J~9、osqv209060300-20406080100120140Elutionvolumn/ml图2:分子筛纯化Sp1(530-623)蛋白色谱图Apo蛋白制备a)三个锌指Apo态制备:往Spl(530-623)蛋白样品中加入EDTA(25mM左右)和DTT(50mM左右),37度反应2小时,脱盐柱处理即可。b)单个锌指、三个锌指的Apo态蛋白都很稳定,浓度可以配到mM级;蛋白保存1.对于三个锌指Spl的保存与使用:a)把分子筛纯化后Spl(530-623)蛋白通过脱盐过程换成如下buffer(50mMHEPES,100mMNaNO3pH610、.8)。b)完成buffe】更换,UV定其浓度后,分管分装,500^1/管,・80度冻存备用c)每次使用时候,取出来1支在4度条件下解冻;2.稳定性问题a)Spl蛋白比较稳定,・80冻存可以保
9、osqv209060300-20406080100120140Elutionvolumn/ml图2:分子筛纯化Sp1(530-623)蛋白色谱图Apo蛋白制备a)三个锌指Apo态制备:往Spl(530-623)蛋白样品中加入EDTA(25mM左右)和DTT(50mM左右),37度反应2小时,脱盐柱处理即可。b)单个锌指、三个锌指的Apo态蛋白都很稳定,浓度可以配到mM级;蛋白保存1.对于三个锌指Spl的保存与使用:a)把分子筛纯化后Spl(530-623)蛋白通过脱盐过程换成如下buffer(50mMHEPES,100mMNaNO3pH6
10、.8)。b)完成buffe】更换,UV定其浓度后,分管分装,500^1/管,・80度冻存备用c)每次使用时候,取出来1支在4度条件下解冻;2.稳定性问题a)Spl蛋白比较稳定,・80冻存可以保
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